一種核酸載體及其用途制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種核酸載體及其用途。本發(fā)明專利技術(shù)還涉及含有所述核酸載體和核酸分子的復(fù)合物，以及所述核酸載體/核酸分子復(fù)合物的制備方法及用途。具體地，本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種核酸載體，其為式I所示的化合物或其可藥用鹽。本發(fā)明專利技術(shù)的核酸載體具有很高的轉(zhuǎn)染效率，并且具有制備方法簡單，細(xì)胞毒性低等優(yōu)點，為基因治療提供了有效的技術(shù)手段。A–B–C–D式I。

A Nucleic Acid Carrier and Its Application

The invention belongs to the field of biomedicine, and relates to a nucleic acid carrier and its use. The invention also relates to a complex containing the nucleic acid carrier and the nucleic acid molecule, as well as a preparation method and application of the nucleic acid carrier/nucleic acid molecule complex. Specifically, the present invention relates to a nucleic acid carrier, which is a compound shown in formula I or a medicinal salt thereof. The nucleic acid carrier of the invention has high transfection efficiency, simple preparation method, low cytotoxicity, etc., and provides an effective technical means for gene therapy. A-B-C-D I.

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
一種核酸載體及其用途
本專利技術(shù)屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種核酸載體及其用途。本專利技術(shù)還涉及含有所述核酸載體和核酸分子的復(fù)合物，以及所述核酸載體/核酸分子復(fù)合物的制備方法及用途。
技術(shù)介紹
美國食品藥品管理局(FDA)將基因治療定義為通過轉(zhuǎn)錄或翻譯、轉(zhuǎn)運和/或整合到宿主基因組中的外源基因進行治療疾病的一種治療方法。基因治療是治療癌癥、單基因疾病、心血管疾病和神經(jīng)性疾病等的潛在的最有效的治療方法。自1990年，基因治療第一次進入臨床試驗開始，全球已經(jīng)有超過1800例基因治療臨床試驗開展。我國更是在2004年，成為第一個在市場上引進基因藥物(Gendicine)的國家。由于用于基因治療的核酸藥物分子具有分子量大、富含大量負(fù)電荷以及極易降解等特點，目前基因治療面臨的最大難題是缺乏理想的轉(zhuǎn)運載體，因此尋找高效、安全的基因轉(zhuǎn)運載體成為研究的重點。目前開展的臨床試驗大多采用腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒作為基因藥物的載體，但病毒載體的缺點在于轉(zhuǎn)運能力低、使用成本高昂和潛在的安全性問題等。在1994年，因為在臨床試驗中使用病毒基因載體造成病人死亡，致使基因治療研究一度陷入停滯。因此，近些年非病毒類載體研究發(fā)展迅速，包括脂質(zhì)體、陽離子聚合物和多肽等。非病毒載體轉(zhuǎn)運基因藥物多數(shù)通過自身的陽離子與基因藥物的陰離子之間的離子相互作用負(fù)載DNA或RNA，形成較小尺度的納米顆粒，轉(zhuǎn)運DNA或RNA進入宿主細(xì)胞，進而整合到宿主基因組中進行表達。多肽以其較好的生物相容性、功能多樣性和易于合成等特點成為基因治療載體的較好選擇。細(xì)胞透膜肽(Cell-PenetratingPeptides,CPPs)是一類能夠高效介導(dǎo)核酸、蛋白等生物大分子透過細(xì)胞膜進入細(xì)胞的一類短肽，一般肽序列長度不超過30個氨基酸，大部分透膜肽富含賴氨酸和精氨酸等堿性氨基酸。其中，TAT(49-57)(HIVtatprotein)是細(xì)胞透膜蛋白肽片段中可完全行使細(xì)胞透膜功能且無細(xì)胞毒性的最小片段，TAT(49-57)肽序列為Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg(RKKRRQRRR，SEQIDNO：7)。該段透膜肽可以通過在生理條件下其堿性氨基酸的正電荷與核酸的負(fù)電荷結(jié)合，負(fù)載核酸進而通過內(nèi)吞作用介導(dǎo)核酸進入細(xì)胞，并且TAT肽片段有一定的細(xì)胞核靶向能力。然而，通過內(nèi)吞作用進入細(xì)胞的TAT/DNA或RNA復(fù)合體首先進入內(nèi)涵體(endosome，一種內(nèi)部呈酸性環(huán)境的脂膜結(jié)構(gòu))，最終運送至溶酶體降解。富含精氨酸的透膜肽肽序列Rn(n＝6－10)也具有和TAT相似的特性。由于TAT和Rn缺乏逃逸內(nèi)涵體的能力，因此很難單獨作為遞送DNA的載體達到理想的轉(zhuǎn)染效率。實現(xiàn)內(nèi)涵體逃逸的方法主要有兩種，一種是利用酸性環(huán)境(pH<6.0)下具有離子緩沖作用的材料，通過質(zhì)子泵作用破壞內(nèi)涵體，使DNA或RNA復(fù)合體逃逸；另一種是利用帶有α-螺旋雙親性結(jié)構(gòu)的多肽與脂膜作用，形成空洞，釋放出來DNA或RNA復(fù)合體。組氨酸能夠在酸性的內(nèi)涵體中不斷吸收質(zhì)子，通過“質(zhì)子海綿”效應(yīng)漲破內(nèi)涵體，進而起到破壞內(nèi)涵體脂質(zhì)囊泡的作用。層粘連蛋白(laminin,LN)是一種大分子膠原糖蛋白。隨著對LN的深入研究，發(fā)現(xiàn)LN具有多種生物學(xué)作用：促進細(xì)胞的粘著、鋪展、有絲分裂、加速神經(jīng)軸突生長及細(xì)胞移動，并誘導(dǎo)細(xì)胞分化，還與形態(tài)發(fā)生和腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)。層粘連蛋白受體(LN-R)廣泛存在于上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、周圍神經(jīng)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及大部分腫瘤細(xì)胞表面，在體外與LN的結(jié)合表現(xiàn)出高親和性、競爭性、濃度與時間依賴性。當(dāng)惡性腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移時，細(xì)胞表面的LN-R與LN粘附是腫瘤細(xì)胞與基底膜相互作用關(guān)鍵的一步，為腫瘤黏附、侵襲突破基底膜提供了分子基礎(chǔ)；同時LN-R不僅能促進細(xì)胞在LN基質(zhì)上黏附，而且能誘導(dǎo)細(xì)胞的趨化性遷移和IV型膠原酶的分泌；也發(fā)現(xiàn)早期階段的LN-R和LN對腫瘤的新生血管形成至關(guān)重要。目前，尚需要開發(fā)轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞毒性低的新的核酸載體。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)人經(jīng)過深入的研究和創(chuàng)造性的勞動，得到了一種核酸載體即式I化合物。本專利技術(shù)人驚奇地發(fā)現(xiàn)，該核酸載體具有較高轉(zhuǎn)染效率并且細(xì)胞毒性較低。此外，該核酸載體還能夠較好地實現(xiàn)內(nèi)涵體逃逸。由此提供了下述專利技術(shù)：本專利技術(shù)的一個方面涉及式I所示的化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽，A–B–C–D式I其中，A表示細(xì)胞透膜肽，B表示內(nèi)涵體逃逸片段，C表示一個或多個Lys，和/或一個或多個Arg，或者C缺失，D表示層粘連蛋白受體靶向片段，并且A和B之間，B和C之間，和/或C和D之間，為直接連接或者通過連接接頭連接；優(yōu)選地，式I化合物還連接有一個或多個疏水分子E，并且所述疏水分子E連接在所述式I化合物中的Lys和/或Arg的側(cè)鏈的氨基上。所述直接連接可以是，例如A和B之中的一個的羧基和另一個的氨基之間形成酰胺鍵。B和C之間、C和D之間也可做類似理解。所述連接接頭，包括但不限于：一個或多個Gly、一個或多個Lys、和/或者一個或多個Cys。所述多個可以是例如2－20個、2－15個、2－10個、2－8個、2－6個、2個、3個、4個、5個或6個。所述A和B之間，B和C之間，以及C和D之間的連接接頭可以相同或不同。連接接頭與A、B、C或D的連接也是通過羧基和氨基形成酰胺鍵連接。在本專利技術(shù)的一個實施方案中，所述的式I化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其特征在于如下的(1)－(5)項中的任意一項或者多項：(1)所述細(xì)胞透膜肽選自TAT、Rn(n＝6、7、8、9或10)、penetratin、MAP、pVEC、MPG、MPGΔNLS、Stearyl-R8、EB1和Tat-DRBD中的任意一種或者多種；(2)所述內(nèi)涵體逃逸片段為質(zhì)子泵內(nèi)涵體逃逸片段，優(yōu)選地，為一個或多個His，例如4－10、4－8、4－6、4、5、6、7或8個His；優(yōu)選為6個His；(3)所述層粘連蛋白受體靶向片段為YIGSR(SEQIDNO：17)或YIGSK(SEQIDNO：18)；(4)所述疏水分子選自碳原子數(shù)大于或等于12的脂肪酸(例如硬脂酸、棕櫚酸、油酸、亞油酸、軟脂酸)、膽固醇和磷脂；(5)所述疏水分子連接在C中的Lys和/或Arg的側(cè)鏈的氨基上。在本專利技術(shù)的一個實施方案中，所述的式I化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中，所述化合物如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2或SEQIDNO:4所示。在本專利技術(shù)的一個實施方案中，所述的式I化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中，氨基酸序列的N末端乙酰化和/或C末端酰胺化。根據(jù)本專利技術(shù)中任一項所述的式I化合物或其可藥用鹽或者本專利技術(shù)的復(fù)合物，其用于基因治療。在本專利技術(shù)中，組氨酸中咪唑基的pKa約為6.0，能夠在酸性內(nèi)涵體中大量吸收質(zhì)子，形成“質(zhì)子海綿”效應(yīng)，造成內(nèi)涵體的破裂。不拘于理論的限制，通過連接疏水性分子，提供疏水性環(huán)境，有利于帶正電荷的親水性氨基酸與帶負(fù)電荷的核酸藥物充分接觸，進而形成穩(wěn)定致密的納米復(fù)合物，有利于細(xì)胞的攝取，可以通過疏水相互作用提高聚集體的局部濃度，進而提高局部電荷密度，提高DNA或RNA的負(fù)載能力、提高核酸載體/DNA或RNA復(fù)合體的穩(wěn)定性，同時，通過其疏水性烷基鏈與細(xì)胞膜的融合作用，進而有效提高透膜效率和破壞內(nèi)涵體的能力。在本專利技術(shù)的一個實施方案中，所述核酸載本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
1.式I所示的化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽，A–B–C–D式I其中，A表示細(xì)胞透膜肽，B表示內(nèi)涵體逃逸片段，C表示一個或多個Lys，和/或一個或多個Arg，或者C缺失，D表示層粘連蛋白受體靶向片段，并且A和B之間，B和C之間，和/或C和D之間，為直接連接或者通過連接接頭連接；優(yōu)選地，式I化合物還連接有一個或多個疏水分子E，并且所述疏水分子E連接在所述式I化合物中的Lys和/或Arg的側(cè)鏈的氨基上。

【技術(shù)特征摘要】
1.式I所示的化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽，A–B–C–D式I其中，A表示細(xì)胞透膜肽，B表示內(nèi)涵體逃逸片段，C表示一個或多個Lys，和/或一個或多個Arg，或者C缺失，D表示層粘連蛋白受體靶向片段，并且A和B之間，B和C之間，和/或C和D之間，為直接連接或者通過連接接頭連接；優(yōu)選地，式I化合物還連接有一個或多個疏水分子E，并且所述疏水分子E連接在所述式I化合物中的Lys和/或Arg的側(cè)鏈的氨基上。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的式I化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其特征在于如下的(1)－(7)項中的任意一項或者多項：(1)所述細(xì)胞透膜肽選自TAT、Rn(n＝6、7、8、9或10)、penetratin、MAP、pVEC、MPG、MPGΔNLS、Stearyl-R8、EB1和Tat-DRBD中的任意一種或者多種；(2)所述內(nèi)涵體逃逸片段為質(zhì)子泵內(nèi)涵體逃逸片段，優(yōu)選地，為一個或多個His，例如4－8個His，優(yōu)選為6個His；(3)所述層粘連蛋白受體靶向片段為如SEQIDNO:17或SEQIDNO:18所示；(4)所述疏水分子選自碳原子數(shù)大于或等于12的脂肪酸(例如硬脂酸、棕櫚酸、油酸、亞油酸或軟脂酸)、膽固醇和磷脂；(5)所述疏水分子連接在C中的Lys和/或Arg的側(cè)鏈的氨基上；(6)所述連接接頭為一個或多個Gly、一個或多個Lys或者一個或多個Cys；(7)式I化合物的氨基酸序列的N末端乙酰化和/或C末端酰胺化。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的式I化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中，所述化合物如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2或SEQIDNO:4所示。4.一種復(fù)合物，其包含權(quán)利要求1至3中任一權(quán)利要求所述的式I化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，以及核酸分子。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的復(fù)合物，其中，所述式I...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：孟慶斌，康子瑤，孟昭，孫超，楊森，劉克良，
申請(專利權(quán))人：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：北京,11