一種酶法制備谷胱甘肽的方法技術

本發明專利技術公開了一種酶法制備谷胱甘肽的方法，包括以下步驟：(1)利用GshF酶、ATP再生酶和AK酶在反應器中生成谷胱甘肽；(2)在反應器中分離固定化的GshF酶、ATP再生酶和AK酶，或使用過濾設備分離游離的GshF酶；(3)將步驟(2)得到的濾出液進行分離，得粗產物GSH以及少量的ATP、ADP和AMP；(4)將步驟(3)得到的GSH通過濃縮、結晶、干燥制備成品GSH。本發明專利技術具有以下優點：使用腺苷替代ATP或AMP，為工業生產節約了大量成本；優化了GSH生產的反應條件，反應速率快；建立了穩定的酶回收體系，節能環保；副產物可直接用于循環反應，或集中收集用于生產ATP，操作簡單。

A method of enzymatic preparation of glutathione

The invention discloses a method for preparing glutathione by enzymatic method, which comprises the following steps: (1) producing glutathione in a reactor by using GshF enzyme, ATP regenerative enzyme and AK enzyme; (2) separating immobilized GshF enzyme, ATP regenerative enzyme and AK enzyme in a reactor, or separating free GshF enzyme by using a filter device; (3) separating the filtrate obtained by step (2) separating the filtrate solution to obtain crude product GSH and a small amount of GSH. ATP, ADP and AMP; (4) The GSH obtained in step (3) was concentrated, crystallized and dried to prepare the finished GSH. The invention has the following advantages: using adenosine instead of ATP or AMP saves a lot of cost for industrial production; optimizing the reaction conditions of GSH production with fast reaction rate; establishing a stable enzyme recovery system, energy saving and environmental protection; by-products can be directly used for cyclic reaction, or centralized collection for ATP production, with simple operation.

【技術實現步驟摘要】
一種酶法制備谷胱甘肽的方法
本專利技術涉及谷胱甘肽的制備方法，特別涉及一種酶法制備谷胱甘肽的方法，具體為使用腺苷代替ATP的酶法制備谷胱甘肽的方法。
技術介紹
谷胱甘肽廣泛存在于動植物和微生物中，是生物體內最重要的非蛋白巰基化合物之一，具有還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)，生物體內大量存在并起主要作用的是GSH，廣泛用于治療肝臟疾病、腫瘤、氧中毒、衰老和內分泌疾病，并作為生物活性添加劑及抗氧化劑用于食品、化妝品領域。GSH由谷氨酸(Glu)、半胱氨酸(Cys)和甘氨酸(Gly)經肽鍵縮合而成的三肽。相對分子質量為307.32，等電點為5.93，常溫下為白色晶體，易溶于水、低濃度乙醇水溶液、液氨和二甲基甲酰胺等溶劑。目前谷胱甘肽的主要制備方法有：溶劑萃取法、化學合成法、生物發酵法和酶法。萃取法從谷物胚芽中提取GSH，由于GSH得率低、成本高、有機溶劑污染嚴重、純度不高，而且消耗大量糧食，現已較少使用。化學合成法合成GSH，由于活性產物不易分離，需要化學拆分，產品純度不高，難以推廣。目前國內外GSH生產基本采用發酵法，原理是將編碼GSH合成酶系的基因克隆到細菌或酵母中，使用微生物發酵生產GSH。發酵法，尤其是酵母發酵法工藝較成熟，但生產周期長，產量偏低，且過多的副產物使下游工藝處理復雜，需使用銅鹽法沉淀GSH，環境污染較大。近年來酶法生產GSH技術有較大提高。新型的雙功能谷胱甘肽合成酶(GshF，EC6.3.2.-)逐漸取代原有的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GshI，EC6.3.2.2)和谷胱甘肽合成酶(GshII，EC6.3.2.2)兩種酶，用來酶法催化生產GSH，反饋抑制作用較小，非常適合應用于大規模生產。理論上，無論使用GshI和GshII酶組合或者使用單一GshF酶合成GSH都需要三磷酸腺苷(ATP)作為能量供體，現階段工業化生產GSH的難題是如何提高ATP利用率，降低ATP的使用量。通常生產1kgGSH至少需使用3-5kg的ATP，成本過高。專利CN201210201691.2使用酵母糖酵解再生ATP，效果穩定。但使用酵母會在反應體系中引入色素等雜質，給進一步純化增加難度。專利CN201510762184.X與CN201610167664.6中使用酶法再生ATP，取得了很好的效果。ATP再生酶包括多聚磷酸激酶(PPK，EC2.7.4.1)、腺苷酸激酶(ADK，EC2.7.4.3)和多聚磷酸-腺苷酸磷酸轉移酶(PAP，EC2.7.4.-)。其中，PPK酶催化ADP與多聚磷酸或其鹽反應生成ATP，ADK酶催化2分子ADP生成1分子ATP和1分子AMP，PAP酶則催化AMP與多聚磷酸或其鹽反應生成ADP。PPK、ADK及PAP三種酶的合理組合均可再生ATP。但使用此方法仍需加入一定量的ATP進行酶促反應。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題是提供一種酶法制備谷胱甘肽的方法，其在原有含有GshF及ATP再生酶的反應體系中添加腺苷激酶(AK，EC2.7.1.20)，該酶可催化腺苷生成AMP，組合上述其它ATP再生酶，可不使用ATP，僅添加少量腺苷即可規模化生產GSH。本專利技術所要解決的技術問題是通過以下技術方案來實現的：一種酶法制備谷胱甘肽的方法，包括以下步驟：(1)利用GshF酶、ATP再生酶和AK酶在反應罐中生成谷胱甘肽：通過基因工程改造、發酵、純化獲得GshF酶、ATP再生酶和AK酶，或以自然提取等其它方式獲得GshF酶、ATP再生酶和AK酶。上述所有酶可以以游離酶的形式制成酶液；也可進一步固定于固定化載體上，制得固定化酶。在反應體系中按比例添加GshF酶、ATP再生酶和AK酶，反應生成GSH，其中，所述反應體系為含有底物谷氨酸(Glu)或其鹽、半胱氨酸(Cys)或其鹽、甘氨酸(Gly)或其鹽、腺苷、多聚磷酸或其鹽以及鎂離子和錳離子的一種或兩種的水溶液。另外，反應體系中還可包含鉀離子、鈉離子、銨離子的一種或幾種，Tris和磷酸根離子的一種或幾種。上述添加的底物、酶及各類鹽可一次性加入反應體系，也可按照工業生產工藝流程分批次流加補入。(2)在反應罐中分離固定化的GshF酶、ATP再生酶和AK酶，或使用過濾設備分離游離的GshF酶：固定化的GshF酶、ATP再生酶和AK酶在反應罐中直接分離。上述分離可通過濾袋分離，也可在反應柱中直接分離。游離的GshF酶、ATP再生酶和AK酶通過過濾器中超濾膜分離。其中，過濾器具有進料口、出料口和回流口，內設截留分子量不大于20kDa的超濾膜。經過過濾器的截留液為回收的酶液，濾出液為分離出酶之后含產物的反應液。(3)通過離子交換法將步驟(2)得到的濾出液進行分離，分離得粗產物GSH以及少量的ATP、ADP和AMP：通過離子交換法，從上述步驟(2)的濾出液中分離粗產物GSH，經離子交換后的穿出液中主要含有少量ATP、ADP、AMP。(4)將步驟(3)得到的GSH通過濃縮、結晶、干燥制備成品GSH。優選地，上述技術方案中，所述酶法制備谷胱甘肽的方法還包括以下步驟：(5)所述步驟(2)中分離的GshF酶、ATP再生酶和AK酶循環利用：即將分離的GshF酶、ATP再生酶和AK酶添加至反應罐中生成GSH的連續反應；(6)GshF、ATP再生酶和AK酶的連續分離：即連續分離固定化的GshF酶、ATP再生酶和AK酶或使用過濾設備連續分離游離的GshF酶、ATP再生酶和AK酶。優選地，上述技術方案中，所述酶法制備谷胱甘肽的方法還包括以下步驟：(7)產物GSH的連續分離：反應生成的GSH通過過濾和/或離子交換方法分離。(8)ATP、ADP和AMP的連續分離：反應生成的ATP、ADP和AMP通過過濾或離子交換方法分離，分離后的產物可直接添加至反應體系或進一步分離純化后制成純品。優選地，上述技術方案中，所述步驟(1)至步驟(4)可以重復至少一次；優選重復多次，例如重復2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50次。優選地，上述技術方案中，所述步驟(1)中在反應罐中生成谷胱甘肽的反應條件如下：反應溫度為25-55℃，優選溫度為30-50℃；反應pH為5-10，優選pH為6-9；反應體系為含有底物氨基酸或其鹽；腺苷；多聚磷酸或其鹽；鎂離子或錳離子的一種或多種組合；在反應體系中添加GshF酶、ATP再生酶和AK酶，反應生成谷胱甘肽。優選地，上述技術方案中，所述步驟(1)中在反應罐中生成谷胱甘肽的反應體系中還包括：鈉離子、鉀離子或銨離子的一種或多種組合；Tris或磷酸鹽的水溶液的一種或兩種組合；鉀離子濃度為0.01-0.5M；鈉離子濃度為0.01-0.5M；銨離子濃度為0.01-0.3M；Tris濃度為0.01-0.1M；磷酸鹽濃度為0.01-0.1M。優選地，上述技術方案中，所述氨基酸或其鹽為L型氨基酸或其鹽，優選為谷氨酸或其鹽(Glu)、半胱氨酸或其鹽(Cys)、甘氨酸或其鹽(Gly)。按其經濟成本及反應最優條件計算，三種氨基酸添加質量比優選為Glu:Cys:Gly＝(1-2.5):1:(0.5-1.5)，更優選為Glu:Cys:Gly＝(1.2-2):1:(0.8-1.5)；半胱氨酸(Cys)添加濃度優選為1-50g/L。優選地，上述技術方本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.一種酶法制備谷胱甘肽的方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)利用GshF酶、ATP再生酶和AK酶在反應罐中生成谷胱甘肽；(2)在反應罐中分離固定化的GshF酶、ATP再生酶和AK酶，或使用過濾設備分離游離的GshF酶；(3)通過離子交換法將步驟(2)得到的濾出液進行分離，得粗產物GSH以及少量的ATP、ADP和AMP；以及(4)將步驟(3)得到的GSH通過濃縮、結晶、干燥制備成品GSH。

【技術特征摘要】
1.一種酶法制備谷胱甘肽的方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)利用GshF酶、ATP再生酶和AK酶在反應罐中生成谷胱甘肽；(2)在反應罐中分離固定化的GshF酶、ATP再生酶和AK酶，或使用過濾設備分離游離的GshF酶；(3)通過離子交換法將步驟(2)得到的濾出液進行分離，得粗產物GSH以及少量的ATP、ADP和AMP；以及(4)將步驟(3)得到的GSH通過濃縮、結晶、干燥制備成品GSH。2.根據權利要求1所述的一種酶法制備谷胱甘肽的方法，其特征在于，所述酶法制備谷胱甘肽的方法還包括以下步驟：(5)所述步驟(2)中分離的GshF酶、ATP再生酶和AK酶循環利用：即將分離的GshF酶、ATP再生酶和AK酶添加至反應罐中生成GSH的連續反應；(6)GshF酶、ATP再生酶和AK酶的連續分離：即連續分離固定化的GshF酶、ATP再生酶和AK酶或使用過濾設備連續分離游離的GshF酶、ATP再生酶和AK酶；(7)產物GSH的連續分離：反應生成的GSH通過過濾和/或離子交換方法分離；(8)ATP、ADP和AMP的連續分離：反應生成的ATP、ADP和AMP通過過濾或離子交換方法分離，分離后的產物可直接添加至反應體系或進一步分離純化后制成純品。3.根據權利要求1所述的一種酶法制備谷胱甘肽的方法，其特征在于，所述步驟(1)至步驟(4)可以重復至少一次；優選重復多次，例如重復2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50次。4.根據權利要求1所述的一種酶法制備谷胱甘肽的方法，其特征在于，所述步驟(1)中在反應罐中生成谷胱甘肽的反應條件如下：反應溫度為25-55℃，優選溫度為30-50℃；反應pH為5-10，優選pH為6-9；反應體系為含有底物氨基酸或其鹽；腺苷；多聚磷酸或其鹽；以及鎂離子或錳離子的一種或多種組合。在反應體系中添加GshF酶、ATP再生酶和AK酶，反應生成谷胱甘肽。5.根據權利要求1所述的一種酶法制備谷胱甘肽的方法，其特征在于，所述步驟(1)中在反應罐中生成谷胱甘肽的反應體系中還包括：鈉離子、鉀離子或銨離子的一種或多種組合；Tris或磷酸鹽的水溶液的一種或兩種組合；其中，鈉離子濃度為0.01-0.5M；鉀離子濃度為0.01-0.5M；銨離子濃度為0.01-0.3M；Tris濃度為0.01-0.1M；磷酸鹽濃度為0.01-0.1M。6.根據權利要求4所述的一種酶法制備谷胱甘肽的方法，其特征在于，所述氨基酸...

【專利技術屬性】
技術研發人員：劉珊珊，劉輝，周穩文，秦永發，
申請(專利權)人：深圳市古特新生生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：廣東,44