一種百合皂苷單體的分離純化方法技術

本發明專利技術提供一種百合皂苷單體的分離純化方法。本發明專利技術以百合干燥肉質鱗葉為原料，經特定濃度的乙醇提取，大孔吸附樹脂進行粗分，然后在高效液相色譜儀監控的條件下，以Sephadex?LH?20凝膠色譜柱細分，最后經過反向硅膠色譜柱純化，得到三個單體化合物。本發明專利技術通過最適宜的工藝及參數條件的組合，可有效除去百合中的大量雜質，一次性可獲取多個的已知活性的百合皂苷，從而可為皂苷類化合物的活性研究和單一成分的新藥開發提供物質基礎。

【技術實現步驟摘要】
一種百合皂苷單體的分離純化方法
本專利技術涉及中藥活性成分的分離提純
，尤其涉及一種百合皂苷單體的分離純化方法。
技術介紹
百合在全國分布廣泛，該味藥性味甘寒，具有養陰清肺、清心安神的功效，用于治療陰虛久咳、痰中帶血、驚悸、虛煩、失眠多夢及精神恍惚等癥，為藥食兼用之品。據《本草綱目》記載，百合具有補益心肺、固腎、補腦、清心、安神、清潤肺燥、調理脾胃、益氣調中、清熱止咳、養陰止血和消暑等功效。百合主要含有甾體皂苷、生物堿類、酚酸甘油酯、磷脂、多糖、氨基酸和類黃酮等成分。其中，甾體皂苷類化合物是其主要活性成分，具有抗抑郁、抗氧化、抗炎、抗癌等生物活性。為了揭示以皂苷類化合物為主要活性成分的中藥治療疾病的物質基礎，并充分利用百合甾體皂苷類單體化合物的藥理活性，需要將百合皂苷的單體進行分離純化，但是百合中存在大量結構相似的皂苷類化合物使得甾體類皂苷單體化合物的分離十分困難，且皂苷類化合物一般只在紫外末端有吸收，這給利用高效液相色譜在線檢測皂苷化合物帶來了困難，因此，如何實現對百合中皂苷單體的分離純化一直是困擾研發人員的難題。
技術實現思路
針對現有分離提取方法無法實現對百合皂苷單體的分離純化的問題，本專利技術提供一種百合皂苷單體的分離純化方法。本專利技術中所述百合為百合是指百合科植物卷丹、百合或細葉百合，藥材部位為干燥肉質鱗葉。為解決上述技術問題，本專利技術提供的技術方案是：一種百合皂苷單體的分離純化方法，包括以下步驟：步驟一、將百合鱗葉的提取物加入填充有非極性大孔吸附樹脂的層析柱中，分別用3～5個柱體積的水、體積濃度為8～12％的乙醇溶液和體積濃度為38～41％的乙醇溶液洗脫，棄去洗脫液，然后以3～5個柱體積的體積濃度為79～82％的乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，蒸干，得干浸膏；步驟二、將所述干浸膏加入裝有SephadexLH-20的凝膠色譜柱中，用體積濃度為49～53％甲醇溶液或乙醇溶液洗脫，并以高效液相色譜進行檢測監控，以主要峰的紫外吸收峰值作為分段依據，紫外吸收值低于5毫安的計入下一部分，得到5個組分，按照收集的時間順序記為組分1，組分2，組分3，組分4，組分5；步驟三、將所述組分3、組分4和組分5分別純化，得3種對應的單體化合物。與現有技術相比，本專利技術具有以下有益效果：百合中除含有皂苷外，還含有糖類、黃酮類、生物堿類、微量元素等非常復雜的成分，較難實現百合皂苷與其他物質的分離，且百合中皂苷的含量很低，結構及理化性質很相似，很難通過簡單的分離方法一次獲得多個百合皂苷的單體。本專利技術提供的百合皂苷單體分離純化的方法，針對百合中存在的各組分的理化性質，通過上述步驟一至步驟三的順序搭配，以及適當參數的組合，有效除去百合中的大量雜質，獲得純度較高的百合皂苷單體。通過本專利技術提供的百合皂苷單體的分離純化方法，可以實現百合皂苷的目標制備，一次性可獲取多個的已知活性的百合皂苷，同時富集分離微量皂苷，從而可以不斷豐富皂苷庫，為皂苷類化合物的活性研究和單一成分的新藥開發提供物質基礎。優選的，步驟一中，所述百合鱗葉的提取物由如下方法制得：將百合鱗葉粉碎，加入鱗葉4～5倍體積的體積濃度為65～70％的乙醇溶液，加熱回流提取2～3次，減壓濃縮，干燥，得百合鱗葉的提取物。通過上述提取方法可以將百合鱗葉中的大量雜質去除，確保提取物中主要含有皂苷、黃酮等成分。優選的，步驟一中，所述大孔樹脂為聚苯乙烯樹脂型大孔樹脂。更優選的，步驟一中，所述大孔樹脂的型號為D101。優選的大孔樹脂吸附量大，洗脫容易，吸附動力學性能良好，對蛋白、糖類、無機酸、堿、鹽、小分子親水性有機物均不吸附，因而可將一般皂苷類物質與這些物質分離，在較短的時間內取得較好的分離效果。優選的，步驟三中，所述反向硅膠色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱。優選的，步驟二中，高效液相色譜進行檢測監控的條件為：固定相：十八烷基硅烷基鍵合硅膠為填料的色譜柱；檢測波長：203nm；流速：0.8～1.2ml/min；柱溫：25～35℃；流動相：水為流動相A，乙腈為流動相B，梯度洗脫，梯度洗脫順序為：0～5min，流動相A為92％，流動相B為8％；5～12min，流動相A為92％～80％，流動相B為8％～20％；12～25min，流動相A為80％～45％，流動相B為20％～55％；25～30min，流動相A為45％～5％，流動相B為55％～95％；30～35min，流動相A為5％，流動相B為95％。上述流動相A與流動相B的比例為體積比。在高效液相色譜分離過程中，各色譜條件的選擇及其組合很重要，因為它直接影響物質的出峰時間、峰形等；色譜條件主要包括色譜柱(包括填料、柱長、柱溫等)、流動相(包括成分、流速等)、檢測器及檢測波長等。本專利技術提供的色譜條件，可使物質的出峰時間、峰形、分離效果等達到最佳化，實現了百合皂苷單體的高效分離。優選的，所述色譜柱為AgilentSB-C18色譜柱，其規格為2.1×100mm，其填料的粒徑為1.8μm。優選的色譜柱，能夠在較高的溫度和較低的pH條件下使用，固定相不會發生相塌陷現象，可以長時間保持柱效，延長柱壽命。優選的，步驟三中，所述組分3的純化步驟為：將所述組分3加入反向硅膠色譜柱中，用體積濃度為25～27％的乙腈水溶液洗脫，得第一單體化合物。優選的，步驟三中，所述組分4的純化步驟為：將組分4加入反向硅膠色譜柱中，用體積濃度為36～40％的乙腈水溶液洗脫，第二單體化合物。優選的，步驟三中，所述組分5的純化步驟為：將組分5加入反向硅膠色譜柱中，用體積濃度為48～52％的乙腈水溶液洗脫，第三單體化合物。將組分3、組分4和組分5分別通過上述方法純化，可得到純度較高的第一單體化合物、第二單體化合物，第三單體化合物。附圖說明為了更清楚地說明本專利技術實施例中的技術方案，下面將對實施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本專利技術的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。圖1是本專利技術實施例3所制備的第一單體化合物的高效液相色譜圖；圖2是本專利技術實施例3所制備的第二單體化合物的高效液相色譜圖；圖3是本專利技術實施例3所制備的第三單體化合物的高效液相色譜圖。具體實施方式為了使本專利技術的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例，對本專利技術進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本專利技術，并不用于限定本專利技術。實施例1一種百合皂苷單體的分離純化方法：步驟一、將干燥的百合鱗葉粉碎，向其中加入鱗葉4倍體積的65％乙醇溶液，加熱回流提取2次，減壓并回收乙醇溶液后，得百合鱗葉的醇提取物；步驟二、將百合鱗葉的醇提物加入填充有D101大孔吸附樹脂的層析柱中，分別用3個柱體積的水、體積濃度為8％的乙醇溶液和體積濃度為38％的乙醇溶液洗脫，棄去洗脫液，然后以4個柱體積的體積濃度為82％的乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，蒸干，得干浸膏；步驟三、將所述干浸膏加入裝有SephadexLH-20的凝膠色譜柱中，用體積濃度為49％甲醇溶液或乙醇溶液洗脫，并以高效液相色譜進行檢測監控，以主要峰的紫外吸收峰值作為分段依據，紫外吸收值低于5毫安的計入下一部分，得到5個組分，按照收集的時間順序記為組分1，組分2，組分3，組分4本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.一種百合皂苷單體的分離純化方法，其特征在于，包括以下步驟：步驟一、將百合鱗葉的提取物加入填充有非極性大孔吸附樹脂的層析柱中，分別用3～5個柱體積的水、體積濃度為8～12％的乙醇溶液和體積濃度為38～41％的乙醇溶液洗脫，棄去洗脫液，然后以3～5個柱體積的體積濃度為79～82％的乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，蒸干，得干浸膏；步驟二、將所述干浸膏加入裝有Sephadex?LH?20的凝膠色譜柱中，用體積濃度為49～53％甲醇溶液或乙醇溶液洗脫，并以高效液相色譜進行檢測監控，收集得到5個組分，按照收集的時間順序記為組分1，組分2，組分3，組分4，組分5；步驟三、將所述組分3、組分4和組分5分別純化，得3種對應的單體化合物。

【技術特征摘要】
1.一種百合皂苷單體的分離純化方法，其特征在于，包括以下步驟：步驟一、將百合鱗葉的提取物加入填充有非極性大孔吸附樹脂的層析柱中，分別用3～5個柱體積的水、體積濃度為8～12％的乙醇溶液和體積濃度為38～41％的乙醇溶液洗脫，棄去洗脫液，然后以3～5個柱體積的體積濃度為79～82％的乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，蒸干，得干浸膏；步驟二、將所述干浸膏加入裝有SephadexLH-20的凝膠色譜柱中，用體積濃度為49～53％甲醇溶液或乙醇溶液洗脫，并以高效液相色譜進行檢測監控，收集得到5個組分，按照收集的時間順序記為組分1，組分2，組分3，組分4，組分5；步驟三、將所述組分3、組分4和組分5分別純化，得3種對應的單體化合物。2.如權利要求1所述的百合皂苷單體的分離純化方法，其特征在于，步驟一中，所述百合鱗葉的提取物由如下方法制得：將百合鱗葉粉碎，加入鱗葉4～5倍體積的體積濃度為65～70％的乙醇溶液，加熱回流提取2～3次，減壓濃縮，干燥，得百合鱗葉的提取物。3.如權利要求1或2所述的百合皂苷單體的分離純化方法，其特征在于，步驟一中，所述大孔樹脂為聚苯乙烯樹脂型大孔樹脂。4.如權利要求3所述的百合皂苷單體的分離純化方法，其特征在于，步驟一中，所述大孔樹脂的型號為D101。5.如權利要求1所述的百合皂苷單體的分離純化方法，其特征在于，步驟三中，所述反向硅膠色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱。6.如權利要求1所述的百合皂苷單體的分離純化方法，其特征在于...

【專利技術屬性】
技術研發人員：巴曉雨，郝福，侯金才，
申請(專利權)人：河北神威藥業有限公司，京津冀聯創藥物研究北京有限公司，
類型：發明
國別省市：河北,13