蛋白質的生產制造技術

本發明專利技術提供了一種用培養具有表達載體的大腸桿菌生產蛋白質的改進的方法，該載體在轉譯起始密碼子的下游具有蛋白質的結構基因，該方法包括在含有（１）鐵離子，錳離子或其混合物和（２）天然來源的氮源的培養基中培養大腸桿菌以增加在Ｎ末端沒有與轉譯起始密碼子ＡＴＧ相對應的蛋氨酸的蛋白質產量．根據本發明專利技術的方法，可得到高產量的沒有與轉譯起始密碼子ＡＴＧ相對應的Ｎ末端蛋氨酸的蛋白質．（*該技術在2006年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及到生產蛋白質的方法。 各種生理活性蛋白質，象細胞素和肽類激素的存在已被證明，遺傳工程技術上的最新進展已使得能夠大規模生產這些生理活性蛋白質及將其用于臨床。 白細胞介素-2〔下文中簡寫成IL-2;也叫T細胞生長因子(TCGF)〕是一種通過尤其是外源凝集素或異抗原刺激T細胞而產生的淋巴因子〔Science，193，1007(1976)〕。 利用IL-2，到目前為止已經獲得了大量的殺傷T細胞或輔助T細胞以及天然殺傷細胞的無性系(例如Nature，268，154(1977)〕。除直接用于無性繁殖T細胞或天然殺傷細胞外，應用IL-2可導致在體外選擇性增殖能識別并摧毀某種特定抗原，例如一種腫瘤抗原的專一抗原殺傷T細胞。將這樣生長的腫瘤專一性殺傷T細胞引入動物體內能夠控制或抑制腫瘤的生長〔The Journal of Immunology，125，1904(1980)〕。 這些試驗的發現表明了IL-2作為一種抗腫瘤劑應用的可能性。進而得知IL-2重建了缺乏thumus功能的裸鼠輔助T細胞功能〔European Journal of Immunology，10，719，(1980)〕并恢復了殺傷T細胞對異源細胞的感應〔Nature，284，278(1980)〕，因此，IL-2有希望用于治療免疫缺乏癥。 干擾素-α〔下文簡稱IFN-α〕和干擾素-γ(下文簡寫為IFN-γ)是病毒或核酸激活的淋巴細胞產生的淋巴因子，它們具有作用于細胞并使之進入抗病毒狀態的生物學活性，并因此在防御系統或腫瘤免疫系統中起重要作用。 象細胞素這樣一類的蛋白質可象天然產生的一樣獲得，但數量非常有限。然而，重組DNA技術的最新成果已經開創了從大菌桿菌等的培養菌株中回收生物活性蛋白質的方法，這些菌株中分別攜有上述蛋白質基因的表達載體〔對IL-2Nature，302，305(1983)和Nucleic Acids Research，11，4307(1983);對IFN-α，Journal of Interferon Research 1，381(1981);對IFN-γNature，295，503(1982)〕。 因為無論是在真核生物或原核生物中，蛋白質的生物合成起始于表達蛋氨酸的信使RNA密碼子AUG，所以產物蛋白質可能是一種在N末端有蛋氨酸殘基的分子或沒有該殘基的分子甚或兩種分子的混合物。事實上已知在大腸桿菌中，許多細胞蛋白質的末端是蛋氨酸〔Conn & StumpfOutlines of Biochemistry，4th edition，John Wiley & Sous(1976)〕而且大腸桿菌的起始因子IF-3就含有N末端有蛋氨酸殘基的分子和沒有該殘基的分子〔Hoppe-Seyler′s Zeitschrift für Physiologische Chemie，354，1415(1973)〕。說到用重組DNA技術在大腸桿菌中產生的蛋白質，已知對于IFN-α加入于N末端的蛋氨酸殘基百分比大約是50%〔Journal of Interferon Research，1，381(1981)〕，而對于人生長激素則高達100%〔Nature，293，408(1981)〕。然而到目前為止，還沒有在這些蛋白質中蛋氨酸殘基加入百分比控制實例的報道。在他們的用植入了IL-2基因的大腸桿菌菌株生產IL-2蛋白質的方法的研究過程中;本專利技術者發現大腸桿菌產生的IL-2蛋白是由兩種分子構成的，即N末端沒有蛋氨酸殘基的IL-2，這是一種以丙氨酸殘基作為N末端氨基酸〔Ala-IL-2〕起始的分子，以及在N末端加入有蛋氨酸殘基并因此以蛋氨酸丙氨酸殘基〔Met-Ala-IL-2〕起始的分子，后者的含量比前者高得多。 類似的有，已發現大腸桿菌產生的IFN-α和IFN-γ的每一種都是N末端以半胱氨酸起始的分子〔分別為Cys-IFN-α和Cys-IFN-γ〕與N末端加入有蛋氨酸殘基并因此以蛋氨酰半胱氨酸殘基〔分別為Met-Cys-IFN-α和Met-Cys-IFN-γ〕起始的分子的混合物，后者占5-50%。 這些N末端具有蛋氨酸殘基的蛋白質應該具有與天然類型的相應蛋白質相似的生物學活性，但無論如何是與后者不同的物質。因此，已知的方法在生產具有天然類型各自氨基酸序列的蛋白質方面不能完全令人滿意。 本專利技術提供了通過培養具有表達載體的大腸桿菌生產蛋白質的改善方法，表達載體在轉譯起始密碼子的下游含有該蛋白質的結構基因，該方法包括在含有(1)鐵離子，錳離子或其混合物以及(2)天然來源的氮源的培養基中培養大腸桿菌增加N末端沒有對應于轉譯起始密碼子ATG的蛋氨酸的蛋白質產率。 對于上述蛋白質，可提及的有各種各樣的生物活性蛋白質，例如象干擾素(例如IFN-α，IFN-β，IFN-γ)，白細胞介素(例如白細胞介素-I，IL-2)，B細胞生長因子(BGF)，B細胞分化因子(BDF)，巨噬細胞激活因子(MAF)，淋巴毒素(LT)以及腫瘤壞死因子(TNF)一類的細胞素;轉化生長因子(TGF-α);肽蛋白質類激素，例如促紅細胞生成素，表皮生長因子，胰島素和人生長激素;病源微生物抗原蛋白，例如乙型肝炎病毒抗原，流感病毒抗原，口蹄疫病毒抗原和瘧原蟲抗原;酶類，例如肽酶〔組織血纖維蛋白溶酶原激活因子，尿激酶，肽裂解酶(Serratiopeptidase)〕和溶菌酶;以及血清蛋白質，例如人血清白蛋白(HSA)。 本專利技術方法可有效地應用于下述實例，在這些實例中，包括將IL-2，IFN-α和IFN-γ用通過培養某些大腸桿菌菌株而生產。 這里所說的IL-2指的是任何具有象天然人IL-2一樣的生物學或免疫學活性的，諸如IL-2受體結合或抗-IL-2抗體結合功能的物質。例如，這種物質可能是一種具有圖1所示氨基酸序列的多肽〔多肽(Ⅰ)〕或含有多肽(Ⅰ)的生物學或免疫學活性所必需的某個氨基酸序列部分的片段，例如多肽(Ⅰ)在其N末端少一個氨基酸〔EPC(laid open)No 91539〕或4個氨基酸(Japanese Patent Application No58-235638，filed on December 13，1983 and laid open under Japanes Patent Publication No 126088/1985)的片段或多肽(Ⅰ)在C末端位置少幾個氨基酸的片段。而且，這種物質可能是一種多肽，它在其他方面與上述多肽(Ⅰ)是相同的，但是缺少多肽(Ⅰ)的組成氨基酸的一部分或含有一個或幾個多肽(Ⅰ)起始發生的氨基酸以外的氨基酸，例如一種含有一個取代125號半胱氨酸殘基的絲氨酸殘基的多肽(Ⅰ)類似物〔Japanese Patent Publication(laid open)No 93093/1984〕。上述多肽最好是本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種生產蛋白質的方法，培養具有一個表達載體的大腸桿菌，該載體在轉譯起始密碼子下游有為該蛋白質編碼的結構基因，該方法包括在含有（１）鐵離子來源，錳離子來源或其混合物和（２）天然來源的氮源的培養基中培養大腸桿菌，增加在Ｎ末端沒有與轉譯起始密碼子ＡＴＧ相對應的蛋氨酸的蛋白質產量。

【技術特征摘要】
JP 1985-10-3 221517/85;JP 1986-3-3 45667/86;JP 1981、一種生產蛋白質的方法，培養具有一個表達載體的大腸桿菌，該載體在轉譯起始密碼子下游有為該蛋白質編碼的結構基因，該方法包括在含有(1)鐵離子來源，錳離子來源或其混合物和(2)天然來源的氮源的培養基中培養大腸桿菌，增加在N末端沒有與轉譯起始密碼子ATG相對應的蛋氨酸的蛋白質產量。2、根據權項1的方法，其中的蛋白質是選自由細胞素，轉化生長因子，肽蛋白激素，病原微生物抗原蛋白質，酶和血清蛋白質組成的一組生理活性蛋白質。3、根據權項2的方法，其中的細胞素是干擾素或白細胞介素。4、根據權項3的方法，其中的干擾素是干擾素α或干擾素β。5、根據權項3的方法，其中的白細胞介素是白細胞介素2。6、根據權項1的方法，其中的表達載體含有一啟動子。7、根據權項6的方法，其中的啟動子是λPL啟動子。8、根據權項6的方法，其中的啟動子是色氨...

【專利技術屬性】
技術研發人員：北野一昭，藤本茂，
申請(專利權)人：武田藥品工業株式會社，
類型：發明
國別省市：JP[日本]