哺乳動物培養細胞提取液和其調制方法以及使用了該提取液的無細胞系蛋白質合成方法技術

本發明專利技術提供一種至少包括使在提取用液中懸浮的哺乳動物培養細胞急劇凍結的工序的哺乳動物細胞提取液的調制方法、和用該方法調制的哺乳動物培養細胞提取液、以及使用了該提取液的無細胞系蛋白質合成方法。優選該無細胞系蛋白質合成方法包括在進行合成反應之前無細胞系蛋白質合成反應液中含有外來ｍＲＮＡ以外的成分的狀態下的一定時間的保溫工序。（*該技術在2024年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及一種使用了哺乳動物培養細胞提取液的無細胞系蛋白質合成方法以及上述提取液的調制方法。
技術介紹
近年來，以人基因組為代表，很多生物的遺傳信息正在被破解。這其中，作為后基因組研究，注意力被集中在對應這些遺傳信息的蛋白質的功能分析或基因組創藥。將對應這些遺傳信息的蛋白質應用、利用于醫藥品等中，需要短時間內簡單地合成很多種蛋白質。現在，蛋白質的生產方法中廣泛利用的是通過基因重組技術，使用酵母或哺乳動物培養細胞等活細胞的表達系(下面有時稱為“細胞系”)。但是，活細胞為了維持自身功能而有排除外來蛋白質的趨勢，另外，活細胞如果表達細胞毒蛋白質，則由于細胞不能生育等，而有很多難以表達的蛋白質。另一方面，作為不使用細胞系的蛋白質的生產方法，已知有如下所述的無細胞系的蛋白質合成系，即，進行向細胞裂解液或提取液中加入基質或酶等過程等，在試管內備齊生物的遺傳信息翻譯系，使用編碼目的蛋白的mRNA，重新構建可以按照希望的順序使氨基酸結合必要的殘基數的合成系。在這樣的無細胞系蛋白質合成中，難以受到上述細胞系的蛋白質合成之類的限制，能夠不切斷生物的生命進行蛋白質的合成，另外，由于在蛋白質的生產中不伴隨培養等操作，所以與細胞系相比，能夠在短時間內進行蛋白質的合成。進而，在無細胞系蛋白質合成中，由生命體不利用的氨基酸序列構成的蛋白質的大量生產也成為可能，所以被認為是有希望的表達方法。作為提供到這樣的無細胞系的蛋白質合成中的細胞裂解液或提取液，探討使用各種生物來源的提取液，其研究在進展。作為無細胞系蛋白質合成用提取液，至今已知有很多，但是考慮到翻譯后的糖鏈修飾等，由于可以在保持完全活性的狀態下表達人蛋白質，所以希望是與人細胞在生物分類上血緣接近的哺乳動物培養細胞來源的提取液。目前，作為哺乳動物培養細胞來源的無細胞系蛋白質合成用提取液，報道有兔網織紅細胞的系(例如，參照非專利文獻1Pelham et al.，Eur.J.Biochem.67，247-256(1976))、中國倉鼠卵巢(CHO)系(例如，參照專利文獻1特開2000-325076號公報)。但是，在兔網織紅細胞系中，伴隨著向兔皮下注射乙酰苯肼溶液，投藥4～5天后從兔耳采血，然后伴隨所謂調制溶解產物(lysate)的非常繁瑣的操作。另外，在CHO系中，是在惰性氣體環境中，通過使加壓下的CHO減壓而使細胞破碎，調制其提取液，但該方法在制作提取液時需要特別的裝置或器械。進而，由于提取液調制時的細胞數量或氣壓、加壓時間對無細胞系中的蛋白質合成能力產生很大影響，所以在條件設定中需要繁瑣的操作。另外，在通過這樣的方法得到的提取液中，能夠合成的蛋白質的量極少，是可以僅通過引進已進行放射性標記的氨基酸測量其蛋白質合成活性的程度。所以，需要開發出調制容易且蛋白質合成量高的哺乳動物培養細胞來源提取液和其調制方法。
技術實現思路
本專利技術正是為了解決上述課題的專利技術，其目的在于，提供調制容易而且比以往蛋白質合成量高的無細胞系蛋白質合成用哺乳動物培養細胞提取液的調制方法和該哺乳動物培養細胞提取液、以及使用了該哺乳動物培養細胞提取液的無細胞系蛋白質合成方法。本專利技術人等為了解決上述課題而進行潛心研究，結果已至完成本專利技術。即，本專利技術如下所述。本專利技術之一是哺乳動物培養細胞提取液的調制方法，其至少包括使懸浮于提取用液中的哺乳動物培養細胞急劇凍結的工序。本專利技術之二是在本專利技術之一的調制方法中，進而還包括在使其急劇凍結之后解凍哺乳動物培養細胞，并離心分離。本專利技術之三是在本專利技術之一或二所述的調制方法中，急劇凍結是通過液氮進行的。本專利技術之四是在本專利技術之二或三所述的調制方法中，已急劇凍結的哺乳動物培養細胞的解凍是在-10℃～20℃的水浴或冰浴中解凍的。本專利技術之五是在本專利技術之一至四所述的任意調制方法中，提取用液是含有蛋白酶抑制劑。本專利技術之六是在本專利技術之一至五所述的任意調制方法中，哺乳動物培養細胞是淋巴瘤來源的培養細胞。本專利技術之七是在本專利技術之一至五所述的任意調制方法中，哺乳動物培養細胞是生殖巢來源的培養細胞。本專利技術之八是在本專利技術之七所述的調制方法中，哺乳動物培養細胞是中國倉鼠卵巢(CHO)來源的培養細胞。本專利技術之九是在本專利技術之八所述的調制方法中，中國倉鼠卵巢(CHO)是CHO K1-SFM來源。本專利技術之十是哺乳動物培養細胞提取液，是采用本專利技術之一至九所述的任意調制方法調制的。本專利技術之十一是無細胞系蛋白質合成方法，使用了本專利技術之十所述的哺乳動物培養細胞提取液。本專利技術之十二是在本專利技術之十一所述的無細胞系蛋白質合成方法中，在使無細胞系蛋白質合成反應液的組成中除了mRNA以外的反應液進行保溫的工序之后，添加外來mRNA，進行合成反應。本專利技術之十三是在本專利技術之十二所述的無細胞系蛋白質合成方法中，保溫是在0℃～50℃下進行的。附圖說明圖1是表示實施例2的實驗結果的圖表，表示保溫工序(在進行合成反應之前，在無細胞系蛋白質合成反應液中含有外來mRNA以外的成分的狀態下的一定時間的保溫)對合成量有無影響。圖2是表示實施例2的實驗結果的圖表，表示保溫工序的反應液組成和保持時間對合成量的影響。具體實施例方式本專利技術是從哺乳動物培養細胞進行提取來調制哺乳動物培養細胞提取液的方法，其較大的特征在于，至少含有使懸浮于提取用液中的哺乳動物培養細胞急劇凍結的工序。通過利用這樣的方法調制哺乳動物培養細胞提取液，來比較在上述專利文獻1中記載的以往的方法，可以在更緩和的狀態下進行細胞的破碎，可以在不破壞無細胞系蛋白質合成中所必需的成分的情況下取出到細胞外，所以能夠在無細胞系中很容易地調制蛋白質的合成量比以往高的哺乳動物培養細胞提取液。進而，通過本專利技術的方法，也能夠防止來自使用器械等的RNase混入等，另外，沒有在使用了表面活性劑等的試劑的細胞破碎法的情況下所擔心的翻譯反應那樣的物質進入。在本專利技術的調制方法中，需要急劇地凍結在提取用液中懸浮的哺乳動物培養細胞。在本專利技術的調制方法中，“急劇凍結”是指在10秒以下、優選在2秒以下使哺乳動物培養細胞凍結。這是因為，在沒有急劇地使哺乳動物培養細胞凍結的情況下，在蛋白質合成中所必需的成分有可能失活，所以不能達到本專利技術的上述效果。作為如上所述使哺乳動物培養細胞急劇凍結的溫度，通常為-80℃以下，優選為-150℃以下。這是因為，如果以超過-80℃的溫度急劇凍結，蛋白質合成中必需的成分會失活，蛋白質合成能力降低。上述哺乳動物培養細胞的急劇凍結，例如可以通過使用液氮或液氦等惰性氣體等來實現，而優選使用得到容易、成本低的液氮進行。在本專利技術的調制方法中，在從哺乳動物培養細胞進行提取時，只要至少包括使懸浮于提取用液中的哺乳動物培養細胞急劇凍結的工序，則對其它工序沒有特別限制。例如，可以利用在研缽中使用研棒磨碎的方法、使用杜恩斯勻漿器(dounce homogenizer)的方法、使用玻璃珠的方法等在從大腸桿菌或小麥胚芽等得到無細胞系蛋白質合成用的提取液時一直以來進行的各種方法，破碎哺乳動物培養細胞后進行提取，但哺乳動物培養細胞與從大腸桿菌或小麥胚芽等得到無細胞系蛋白質合成用提取液的情況相比，細胞的破碎更容易，進而在通過僅利用這種凍結、解凍的破碎法得到的提取液中，含有蛋白質合成所必需的成分并保持其活性，出于這一理由，能夠得到本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種哺乳動物培養細胞提取液的調制方法，至少包括使懸浮于提取用液中的哺乳動物培養細胞急劇凍結的工序。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：鈴木崇，江連徹，伊東昌章，東出將賢，遠藤幸善，
申請(專利權)人：株式會社島津制作所，
類型：發明
國別省市：JP[日本]