【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及重組DNA技術。一方面，本專利技術涉及甲醇誘導的調節區，另一方面，本項專利技術涉及葡萄糖存在的條件下被阻遇了的調節區域。還有一方面，本專利技術涉及整合了本專利技術的調節區的新型表達載體，以及由此產生的新型轉化體和受調節的多肽的表達。近年來，由于重組DNA技術的發展，所以就使得控制由微生物產生的各種有用多肽成為可能。許多真核多肽如人生長激素、白細胞干擾素、人胰島素、人胰島素原等等已由多種微生物產生。人們期待將來重組DNA技術能有進一步的發展，以便得到更加有效的方法來利用微生物生產有用的多肽產品。一項吸引人的發展將是調節區域的分離和鑒定，該調節區域可以通過選擇適當的培養基、生長條件或其它條件而很容易地打開和關閉。例如，Ellis、Brust、Koutz、Waters、Harpold和Gingeras就曾在1985年5月的《分子及細胞生物學》出版物(1111-1121頁)上揭示了DNA序列的分離和特性鑒定，該序列與甲醇的存在相應答，并且在某些分解代謝抑制碳源如葡萄糖存在的條件下，該序列受到分解代謝產物阻遏。本專利技術是在對上述的參考資料進行進一步的研究后得出的結果。因此，本專利技術的一個目的就是對Ellis等的甲醇應答DNA序列的功能性亞片段進行分離和特性鑒定。本專利技術的這一目的及其它目的從這里所提供的說明書和
【技術保護點】
一種與培養基中的甲醇的存在相應答的ＤＮＡ片段，這種培養基是用于帶有該片段的宿主所生長的；其中所說的片段是作為一種自主成分存在于所述宿主中；且所說片段至少由下列核苷酸序列及其功能等價物組成：５↑〔１〕－ＧＣＴＡＣＴＡＡＣＡ，ＣＣＡＴＧＡＣ ＴＴＴ，ＡＴＴＡＧＣＣＴＧＴ，ＣＴＡＴＣＣＴＧＧＣＣＣＣＣＣＴＧＧＣＧ，ＡＧＧＴＣＡＴＧＴＴ，ＴＧＴＴＴＡＴＴＴＣ，ＣＧＡＡＴＧＣＡＡＣＡＡＧＣＴＣＣＧＣＡ，ＴＴＡＣＡＣＣＣＧＡ，ＡＣＡＴＣＡＣＴＣＣ，ＡＧＡＴＧＡＧＧＧＣＴＴＴ ＣＴＧＡＧＴＧ，ＴＧＧＧＧＴＣＡＡＡ，ＴＡＧＴＴＴＣＡＴＧ，ＴＴＣＣＣＡＡＡＴＧＧＣＣＣＡＡＡＡＣＴ，ＧＡＣＡＧＴＴＴＡＡ，ＡＣＧＣＴＧＴＣＴＴ，ＧＧＡＡＣＣＴＡＡＴＡＴＧＡＣＡＡＡＡＧ，ＣＧＴＧＡＴＣＴＣＡ，ＴＣＣＡＡＧＡＴＧＡ， ＡＣＴＡＡＧＴＴＴＧＧＴＴＣＧＴＴＧＡＡ，ＡＴＧＣＴＡＡＣＧＧ，ＣＣＡＧＴＴＧＧＴＣ，ＡＡＡＡＡＧＡＡＡＣＴＴＧＡＣＧＡＡＴＧ，ＣＴＣＡＡＡＡＡＴＡ，ＡＴＣＴＣＡＴＴＡＡ，ＴＧＣＴＴＡＧＣＧＣＡＧＴＣＴＣＴＣＴＡ，ＴＣＧＣＴＴＣ ＴＧ...
【技術特征摘要】
US 1986-3-14 839845書中明顯可見。本發明人已驚奇地發現由Ellis、Brust、Koutz、Waters、Harpold和Gingeras(Molecular and Cellular Biology，1985年5月，1111-1121頁)等所公布的調節區的獨特亞片段具有獨特的調節性質;一個這樣的調節區當作為染色體成分引進宿主體內時，在甲醇存在的條件下能夠完全誘導;另一個這樣的調節區當作為染色體外成分引進宿主體內時，甲醇能夠對其進行完全誘導;還有另一個這樣的調節區能夠為定位在下游的異源啟動子核苷酸序列提供這樣一種能力，即在甲醇存在的條件下被誘導而在分解代謝產物抑制碳源存在的條件下被阻遏。圖1是畢赤酵母屬的伯醇氧化酶基因(AOXI)的5′區的限制性酶切圖譜。圖2是質粒pSAOH5的限制性酶切圖譜。圖3是在pBR322基礎之上構建的質粒pPG2.5的酵母插入子的限制性酶切圖譜。圖4是質粒pBPf3I的限制性酶切圖譜。圖5是實例中的討論的構建載體的流程圖。下面的縮寫是用在圖中以代表所用的限制性內切酶。縮寫 限制酶A AvaⅡB BamHⅠB2BglⅡBc BclⅠH2HincⅡH3HindⅢK KpnⅡNd1NdeⅠNr NruⅠPs PstⅠPv2PvuⅡR1EcoRⅠR5EcoRVS SalⅠSm SmaⅠSs SstⅠSt StuⅠ附圖中，用于DNA片段的操作的限制性酶切位點用圓括號將破壞位點的縮寫圈起來表示，不過這些點在連接時被破壞。本發明提供了一種新型DNA片段，它包括與培養基中的甲醇的存在相應答的調節區，該培養基是與該DNA片段的宿主體相聯系的。當將本發明的一新型片段作為單拷貝整合進宿主體的基因組(即作為染色體成分而不是作為染色體外成分被攜帶)時，它能夠在甲醇存在的條件下促進完全誘導。當作為宿主體的染色體外成分(即在宿主體內作為自主成分維持)或作為染色體成分時，本發明的另一新型片段在甲醇存在的情況下能夠促進完全誘導。當本發明的DNA片段的調節區位于編碼產生mRNA的DNA的5′末端時，它能夠控制mRNA的轉錄。上述DNA片段的突變型和功能等價物也包括在本發明的范圍之內。“完全誘導”一詞用在本發明書中是指所給DNA片段與甲醇的存在相應答的能力。該詞涉及甲醇與調節區相應答以誘導產生蛋白質產物的水平的能力，該水平與使用同相調節區一結構基因構造物轉化的宿主的野生型AOXI蛋白質編碼序列上游的1Kb非編碼序列新達到的水平相當。本發明進一步提供了一種由上游激活劑序列組成的DNA片段，它賦予位于下游的異源啟動子核苷酸序列這樣一種能力，即在該DNA片段的宿主體所在的培養基中含有甲醇時，能夠誘導其表達，而在含有分解代謝產物抑制碳源時，能夠抑制表達。當將本發明的這一實施方案中的DNA片段的調節區與位于編碼mRNA的5′末端的異源啟動子相結合時，它能夠控制mRNA的轉錄。上述DNA片段突變型和功能等價物也包括在本發明的范圍之內。按照本發明，還可進一步提供質粒和含有上述DNA片段的轉化體，以及使用這種轉化體生產多肽的工序。在本發明的另一實例方案中，還提供了一種通過使用可變數量的可操作調節區的核苷酸來控制調節區對于甲醇的應答的方法。能夠獲得的甲醇應答范圍從微小應答(只有“完全”誘導的百分之幾)直至完全甲醇誘導均可達到。本發明的調節區對于使用重組DNA修飾的宿主用以調節多肽的生產是非常有用的。例如，在本發明的一個實施方案中，從整合表達盒中甲醇誘導多肽產物的表達是可能的。在另一實施方案中，從自主表達盒中甲醇誘導多肽產物的表達也是可能的。按照本發明的另一個實施例，多肽產物的表達受轉化宿主控制，而該宿主帶有一種多肽編碼序列，這一序列在甲醇誘導和分解代謝產物抑制條件相應答的上游激活劑序列的控制之下;并且此后在甲醇或分解代謝產物抑制碳源存在或缺乏的條件下使轉化宿主得以維持。這樣，按照這一具體實施方案，如果需要某一特定水平的多肽產物，就可以對培養基的組成進行調整，直至達到所需水平的多肽產物，然后通過向培養基中加入一種分解代謝產物抑制碳源以阻止多肽編碼序列的進一步表達。按照這后一種實施方案，本發明的上游激活劑序列對于在正常的非調節啟動子的控制條件下完成多肽產物的調節生產是有用的。例如，通過摻入本發明的上游激活劑序列，可以使得組成啟動子對甲醇誘導和分解代謝產物抑制作出反應。按這種方式，任何能夠作為RNA轉錄的一個啟動子的功能序列的表達都可以通過有無甲醇或分解代謝產物抑制碳源而受到控制。將從Ellis、rust、Koutz、Waters、Harpold和Gingeras所揭示的伯醇氧化酶基因(AOX;見圖1)(Molecular and Cellalor Biology，1985年5月，1111-1121頁)的5′端得到的大約1kb的調節區分別從3′末端和5′末端進行BAL31消化，然后將產生的突變啟動子片段與大腸桿菌LacZ基因融合，得到一系列載體。5′端的缺失產生了下列載體表1載體 AO啟動子 缺失區域pSAOH5 -900→ATG nonepBAZ3 -709→ATG 5′191bppBAZ4 -499→ATG 5′401bppBAZ6 -372→ATG 5′528bppBAZ7 -216→ATG 5′684bppBAZ8 -197→ATG 5′703bp載體pSAOH5(見圖2)代表完整的5′-乙醇氧化酶調節區，而載體pBAZ3，4，6，7和8則代表5′端缺失。將這些含有各種調節區一結構基因(lacZ)構建物的載體轉化一種巴斯德畢赤酵母營養突變體，然后當其在作為碳源和能源的甲醇或葡萄糖上生長時，檢測β-半乳糖苷酶的產生。而β-半乳糖苷酶表達結果的詳細分析見實施例，其結果總結如下(a)在ATG起始密碼子上游的709堿基對與499堿基對之間存在一個弱的甲醇應答區，該密碼子是用于含有這些序列的自主載體的，而整合載體的完全甲醇應答不需要上游709至499堿基對的序列。因此，盡管對于整合和自主載體來說，具有0-709核苷酸序列得到了完全用醇誘導，而帶有乙醇氧化酶ATG上游的0-499堿基對，則自主載體僅顯示約為50%的甲醇誘導。由自主載體表達的完全誘導所需要的709個堿基對序列如下所示序列A5′-GCTACTAACA CCATGACTTT ATTAGCCTGT CTATCCTGGCCCCCCTGGCG AGGTCATGTT TGTTTATTTC CGAATGCAACAAGCTCCGCA TTACACCCGA ACATCACTCC AGATGAGGGCTTTCTGAGTG TGGGGTCAAA TAGTTTCATG TTCCCAAATGGCCCAAAACT GACAGTTTAA ACGCTGTCTT GGAACCTAATATGACAAAAG CGTGATCTCA TCCAAGATGA ACTAAGTTTGGTTCGTTGAA ATGCTAACGG CCAGTTGGTC AAAAAGAAACTTCCAAAAGT CGCCATACCG TTTGTCTTGT TTGGTATTGATTGACGAATG CTCAAAAATA ATCTCATTAA TGCTTAGCGCAGTCTCTCTA TCGCTTCTGA ACCCGGTGGC ACCTGTGCCGAAACGCAAAT GGGGAAACAA CCCGCTTTTT GGATGATTATGCATTGTCCT CCACATTGTA TGCTTCCAAG ATTCTGGTGGGAATACTGCT GATAGCCTAA CGTTCATGAT CAAAATTTAACTGTTCTAAC CCCTACTTGG ACAGGCAATA TATAAACAGAAGGAAGCTGC CCTGTCTTAA ACCTTTTTTT TTATCATCATTATTAGCTTA CTTTCATAAT TGCGACTGGT TCCAATTGACAAGCTTTTGA TTTTAACGAC TTTTAACGAC AACTTGAGAAGATCAAAAAA CAACTAATTA TTCGAAACG-3′.帶有象ATG上游的第一個197個這樣少的核苷酸至少觀察到微小的甲醇誘導。(b)在起始密碼子ATG上游的約372和197堿基對之間存在一個強的甲醇應答區。而在起始密碼子ATG上游的372和216堿基對之間存在一個葡萄糖應答區。通過附加實驗(其詳性見實施例)，已表明這一片段具有一上游激活劑序列(UAS)的性質，即它可賦予下游異源啟動子序列具有通過甲醇的存在而被誘導和/或通過一種分解代謝產物抑制碳源如葡萄糖的存在而被抑制。這種UAS片段的序列如下序列B5′-ATA ATCTCATTAA TGCTTAGCGCAGTCTCTCTA TCGCTTCTGA ACCCGGTGGC ACCTGTGCCGAAACGCAAAT GGGGAAACAA CCCGCTTTTT GGATGATTATGCATTGTCCT CCACATTGTA TGCTTCCAAG ATTCTGGTGGGAATACTGCT GATAGCCTAA CGTTCATGAT CAA-3′從5′-AOXI啟動子的3′末端制備一系列缺失，然后依次克隆進5′缺失載體pBAZ6和pBAZ8中，得到的載體序列列于表Ⅱ表Ⅱ載體 缺失pBAZ801 -264→197pBAZ802 -347→197pBAZ803 -445→197pBAZ805 -532→197pBAZ804 -694→197pBAZ604 -445→372pBAZ601 -532→372pBAZ603 -542→372pBAZ602 -694→372表Ⅱ中所列的一套載體在與AOXI的ATG起始密碼子相關的694和197堿基位置之間含有可變的內部缺失。總結于表Ⅱ的載體所含有的啟動子序列的5′部分是從乙醇氧化酶調節區的3′末端缺失得到的，而總結于表Ⅱ的載體所含有的調節區的3′部分是從乙醇氧化酶調節區、pBAZ6和pBAZ8的5′末端缺失得到的。如同前面一樣，用這種調節區-β-半乳糖苷酶結構基因構建物集合轉化一種巴斯德畢赤酵母營養突變株，然后，當其在甲醇或葡萄糖上生長時，以檢測β-半乳糖苷酶的產生。檢測結果的詳細分析見實施例，其結果可概括如下在ATG起始密碼子上游的約260至370核苷酸之間的大約100個堿基對區域內存在一個非常強的甲醇可誘導成分。另外，在ATG起始密碼子上游的約500至700核苷酸鹽區域也發現了一個較弱的甲醇可調節DNA片段。而且，在乙醇氧化酶ATG起始密碼子上游的從約350至375堿基對區域觀察到了一個葡萄糖可抑制區。這一葡萄糖可抑制區正好在甲醇可誘導區上游，且可能與甲醇應答序列相重疊。上述所鑒定的任一甲醇可誘導成分都可以單獨或以重組形式插入表達載體之中，而使甲醇誘導的基因能夠表達。相反地，上面所鑒定的葡萄糖可抑制區可以從甲醇可誘導的啟動子成分中刪掉，這樣，當將經修飾的啟動子用于表達載體且產生的轉化體在葡萄糖存在的條件下生長時，就使得非抑制基因能夠表達。或者，可以將葡萄糖可抑制區特意包括在特殊設計的載體中，以便能夠迅速地控制基因表達的“開-關”。按照本發明的另一個實施方案，本發明提供了一種控制被整合了的調節區的應答的方法，它是在甲醇存在的條件下通過利用一種含有可變數目的堿基對的核苷酸序列作為調節區而完成的。這樣，當使用最小值為下列197個堿基對時，得到了完全甲醇誘導的5%。序列C5′-AAATTTAACTGTTCTAAC CCCTACTTGG ACAGGCAATA TATAAACAGAAGGAAGCTGC CCTGTCTTAA ACCTTTTTTT TTATCATCATTATTAGCTTA CTTTCATAAT TGCGACTGGT TCCAATTGACAAGCTTTTGA TTTTAACGAC TTTTAACGAC AACTTGAGAAGATCAAAAAA CAACTAATTA TTCGAAACG-3′.當所有下列增加序列都被使用時，對于被整合的表達載體觀察到了基本上完全的甲醇誘導序列D5′-ATA ATCTCATTAA TGCTTAGCGCAGTCTCTCTA TCGCTTCTGA ACCCGGTGGC ACCTGTGCCGAAACGCAAAT GGGGAAACAA CCCGCTTTTT GGATGATTATGCATTGTCCT CCACATTGTA TGCTTCCAAG ATTCTGGTGGGAATACTGCT GATAGCCTAA CGTTCATGAT CAA-3′甲醇誘導的近似程度與在被整合表達載體中所使用的調節區的大小的關系列于表Ⅲ表Ⅲ核苷酸序列 甲醇誘導(%)0-197 50-197加347-372 50-197加264-372 250-372 100與此相似，本發明也提供了一種控制自主調節區對于甲醇的存在進行應答的方法，它是通過使用至少含有上述序列C中所列的197個核苷酸的一段核苷酸序列作為調節區而完成的。如果要達到完全甲醇表達還需要下列補加序列序列E5′-GCTACTAACA CCATGACTTT ATTAGCCTGT CTATCCTGGCCCCCCTGGCG AGGTCATGTT TGTTTATTTC CGAATGCAACAAGCTCCGCA TTACACCCGA ACATCACTCC AGATGAGGGCTTTCTGAGTG TGGGGTCAAA TAGTTTCATG TTCCCAAATGGCCCAAAACT GACAGTTTAA ACGCTGTCTT GGAACCTAATATGACAAAAG CGTGATCTCA TCCAAGATGA ACTAAGTTTGGTTCGTTGAA ATGCTAACGG CCAGTTGGTC AAAAAGAAACTTCCAAAAGT CGCCATACCG TTTGTCTTGT TTGGTATTGATTGACGAATG CTCAAAAATA ATCTCATTAA TGCTTAGCGCAGTCTCTCTA TCGCTTCTGA ACCCGGTGGC ACCTGTGCCGAAACGCAAAT GGGGAAACAA CCCGCTTTTT GGATGATTATGCATTGTCCT CCACATTGTA TGCTTCCAAG ATTCTGGTGGGAATACTGCT GATAGCCTAA CGTTCATGAT CAA-3′.甲醇誘導的近似程度與調節區的大小的關系見表Ⅳ表Ⅳ核苷酸序列 甲醇誘導(%)0-197 40-216 130-372 500-499 500-709 100按照本發明的一個實施方案，將序列B所示的上游激活劑序列(UAS)插入到通常對于葡萄糖和/或甲醇的存在不敏感的畢赤酵母序列的上游。當其生長在葡萄糖上時，含有UAS的轉化體的基因產物(β-半乳糖苷酶)的表達被抑制要比不含UAS的構建物，pBPf3I大400倍以上。生長于甲醇上時這一抑制減弱;β-半乳糖苷酶的產生水平要比在葡萄糖上轉化體的那些增加170倍以上。表ⅤpBPf-3Ⅰ中的插入子 生長于甲醇與葡萄糖上時產生的β-半乳糖苷酶的比值無 1.07-197至-372 174具體的轉化株，結果等在實施例中有詳細敘述。根據以下非限定實例，現在對本發明進行更詳細地敘述。實例下面的實例中所用的緩沖液和溶液的組成如下SD平皿 2%瓊脂6.7不含氨基酸的酵母含氮堿基(DIFCO)重量百分比為2的葡萄糖溶于1升水中YNB肉汁培養基 6.7克不含氨基酸的酵母含氮堿基(DIFCO)溶于1升水中Z緩沖液 0.1M磷酸鈉，pH7.00.01M Kcl0.001M Mg SO40.039M β-巰基乙醇X-gal 指示劑平皿 2%瓊脂0.5%(體積)的甲醇6.7克不含氨基酸的酵母含氮堿基(DIFCO)0.4毫克生物素40毫克X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)溶于1升水中，用磷酸二氫鉀(monobasic potassium phosphate將pH調至7-EGTA＝乙二醇-雙-(β-氨基乙基醚)-N，N，N′，N′-四-乙酸(Sigma公司)在下面的實施例中所用到的菌株可以從被承認的保藏單位得到，登記號如下-細菌菌株JM103，HB101和MC1061通常均可得到-畢赤酵母GS115＝NRRL Y-15851-pSAOH5(轉化到GS115＝NRRL Y-15853;轉化到大腸桿菌＝NRRL B-15862)-pBPf3Ⅰ是從質粒pBPf1得到的(登記號為NRRL B-15892)，它用到了下列各步序列將從pYJ8(登記號NRRL B-15889)得到的0.6kbp的EcoRⅠ-PvuⅡ片段(該片段含有畢赤酵母HIS4啟動子序列)插進pBPf1的EcoRⅠ-SmaⅠ位點。所合成的質粒被稱為pBPf3。用PstⅠ和NruⅠ降解質粒pBPf3以釋放出含有lacZ序列的片段。將該片段與pYM4的PstⅠ-EcoRV片段連接，以產生質粒pBPf3Ⅰ，其中pYM4含有插入到pBP322的BamHⅠ位點的pYJ8的BglⅡ片段，而BglⅡ片段又含有HIS4，見圖4所示。-pPG2.5(可從等于NRRL B-15868的pPG4.0得到，詳情見下)實例1AOXI啟動子的5′-末端缺失的構建用EcoRⅠ將30毫克質粒pSAOH5(圖2)完全降解，苯酚抽提，及乙醇沉淀。將得到的干DNA沉淀溶于水(最終反應體積＝100微升)，然后于23℃用1.2單位的BAL31降解。每隔3分鐘，取10微升到10微升40m MEGTA中，然后用苯酚抽提及乙醇沉淀。從每一部分得到的重新溶解的DNA沉淀用1單位的Klenow DNA多聚酶進行處理以增強平末端，然后連接到EcoRⅠ連接子(5′-GGAATTCC-3′)上，再用PstⅠ和EcoRⅠ完全降解以釋放大約9.0kbp的載體片段。然后將PstⅠ-EcoRⅠ所降解的DNA連接到來自pBR2的750bp的PstⅠ-EcoRⅠ片段上，以便再次生出β-內酰胺酶基因。將連接的DNA轉化進JM103，篩選出氨芐青霉素抗性的轉化株。挑選從每一BAL31降解的pSAOH5的等分試樣得到的并且在x-gal指示劑平皿上檢測對β-半乳糖苷酶陽性的單個轉化株，用微量DNA制備方法檢測在AOXI啟動子中含有新的EcoRⅠ限制性位點的質粒的存在。用EcoRⅠ和EcoRV進行完全降解(見圖2)就能夠鑒定含有融合進大腸桿菌lac Z基因中的各種長度的AOXI啟動子的克隆。這些克隆的名稱如下表1載體 AO啟動子 缺失區pSAOH5 -900→ATG nonepBAZ3 -709→ATG 5′191bppBAZ4 -499→ATG 5′401bppBAZ6 -372→ATG 5′528bppBAZ7 -216→ATG 5′684bppBAZ8 -197→ATG 5′703bp然后按照公布過的方法(Cregg等，Molecular and Cellular Biology 5，3376-3385(1985))，用含有這些縮短了的AOXI啟動子序列的質粒轉化巴斯畢赤酵母菌株GS115，篩選出Hi S表型的轉化株。使Hi S轉化株生長于各種碳源上，并且檢測β-半乳糖苷酶的產生(見表Ⅵ)。表Ⅵβ-半乳糖苷酶，單位/OD600自主載體載體 缺失 生長于葡萄糖 生長于甲醇pSAOH5 None 1 1000pBAZ3 5′(191bp) 1 1000pBAZ4 5′(401bp) 1 500pBAZ6 5′(528bp) 1 500pBAZ7 5′(684bp) 15 150pBAZ8 5′(703bp) 15 40基于該項說明，即pBAz6含有甲醇可誘導的-葡萄糖可抑制的序列的大部分，而pBAz8大都缺失了這些應答區，選擇質粒pBAz6和pBAz8用于進一步的研究。實例ⅡAOXI啟動子的3′-末端缺失的構建用BamHⅠ將18毫克的質粒pPG2.5(在pBR322基礎上構建的質粒，它含有pPG4.0的大約2.5kbp的EcoRⅠ-SalⅠ片段，如圖3所示)完全降解苯酚抽提及乙醇沉淀。用1.2單位的BAL31在23℃下消化溶解的DNA沉淀(最終反應體積＝100μl)，每隔3分鐘取10微升的等分試樣到10微升40mM EGTA中，然后用苯酚抽提和乙醇沉淀。用1個單位的Klenow DNA多聚酶處理重新溶解的每一等分試樣中的DNA沉淀，增強平末端，連接到EcoRⅠ連接子上，用來轉化氨芐基青霉素抗性大腸桿菌HB101菌株，從每-BAL31降解的pPG2.5的等分試樣挑選出單個轉化株，用微DNA制備方法檢測在AOXI啟動子中含有新的EcoRⅠ限制性酶切位點的質粒的存在。分離出在AOXI的啟動子中的AOXIATG上游的264，347，445，532，542和694核苷酸位置含有新的EcoRⅠ限制性酶切位點的質粒，且分別定名為pPG2.5△4，△5，△7，△10，△12和△11，然后用EcoRⅠ降解。這些降解分別產生出大約1186，1103，1005，918，908和756個堿基對的新的EcoRⅠ片段。分離并乙醇沉淀所形成的EcoRⅠ片段，該片段含有后來插到BAL31誘變中并定位在EcoRⅠ連接子上游的AOXI啟動子的部分。實例Ⅲ用lacz融合質粒轉化的畢赤酵母的生長挑選一個轉化菌落，劃線接種于SD平皿。將通過劃線得到的一個單菌落接種于50毫升的搖瓶中，其中含有15毫升YNB肉汁培養基和2%...
【專利技術屬性】
技術研發人員：理查德哥爾登布克霍爾茨，
申請(專利權)人：菲利普石油公司，
類型：發明
國別省市：US[美國]
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