改進(jìn)的融合產(chǎn)物制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)介紹了新型的改進(jìn)融合產(chǎn)物。（*該技術(shù)在2007年保護(hù)過期，可自由使用*）

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
由Kohler和Milstein在1975年所進(jìn)行的小鼠骨髓瘤細(xì)胞與已被免疫的小鼠脾細(xì)胞的融合(Nature.256(1975)，495-497)，首次證實(shí)了連續(xù)獲得產(chǎn)生同型(所謂的“單克隆的”)細(xì)胞系的可能性以及由這些雜交瘤制造的抗體在各種科學(xué)研究和醫(yī)學(xué)珍斷上的應(yīng)用。制備雜交瘤的方法一般包括下列步驟(a)用一種致免疫劑免疫小鼠或大鼠一類動(dòng)物。所用的免疫方案應(yīng)該能夠產(chǎn)生有用量的適當(dāng)?shù)囊呀佑|抗原的脾細(xì)胞。(b)從被免疫的動(dòng)物體中取出脾臟，在一種合適的介質(zhì)中制成脾臟懸浮液。(c)在一種合適的融合促進(jìn)劑存在的條件下，將該懸浮的脾細(xì)胞與從一合適的細(xì)胞系得來的骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合。融合促進(jìn)劑可以是仙臺病毒或是一化學(xué)融合劑，如平均分子量約1000至4000的聚乙二醇((PEG)(如商業(yè)上可得到的PEG1000等)。另一項(xiàng)有效的融合技術(shù)是根據(jù)已知方法的電-融合，如Zimmermann和Scheurich(Planta，151(1981)，26-32)、Vienken等(Planta，151(1983)，331)以及Jacob等(Sbud.Biophys，94(1983)，99)等所使用的方法。所用的骨髓瘤細(xì)胞系最好是所謂的“抗藥”型，以便使未融合的骨髓瘤細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基上不能存活，而雜種則能存活，最普通的一類是8-氮鳥嘌呤抗性細(xì)胞系，由于它缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，從而不能夠在HAT(次黃嘌呤、氨基嘌呤和胸苷)培養(yǎng)基中存活。(d)在各個(gè)容器中用選擇培養(yǎng)基稀釋并培養(yǎng)未融合的脾細(xì)胞，未融合的骨髓細(xì)胞和融合細(xì)胞的混合物，這種培養(yǎng)基將不能維持未融合的骨髓細(xì)胞以長時(shí)間而使未融合細(xì)胞死亡(約一周)。稀釋可以是一種有限型，其中稀釋劑的體積是通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算出來的，以便分離一定量的細(xì)胞數(shù)(如微量滴定板的每一孔)。在選擇性培養(yǎng)基中，未融合的骨髓瘤細(xì)胞死掉。由于未融合的脾細(xì)胞是非惡性的，它們僅有有限的代數(shù)，因此，經(jīng)過一段時(shí)間后(約一周)，這些未融合的脾細(xì)胞將不能繁殖。而另一方面，融合細(xì)胞由于具有骨髓瘤親本的惡性性質(zhì)以及脾細(xì)胞親本的在選擇培養(yǎng)基上的存活能力，所以能夠連續(xù)繁殖。(e)鑒定在含有雜交瘤的每一容器(孔)中的上清液中抗體的存在，這種抗體是直接抗最初所使用的抗原的。(f)篩選(如通過有限稀釋)和克隆產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤。一旦所需的雜交瘤被篩選和克隆，則最終的抗體可以通過兩種方式之一產(chǎn)生。最純的單克隆抗體是在試管中在一種合適的培養(yǎng)基上對所需的雜交瘤進(jìn)行適當(dāng)時(shí)間的培養(yǎng)而產(chǎn)生的。然后由上清液中回收所需要的抗體。該適宜的培養(yǎng)基和適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)周期為已知的或很易確定。這一試管技術(shù)生產(chǎn)的基本是單一的單克隆抗體，基本上無其它特定的抗人免疫球蛋白。既然培養(yǎng)基中含有異種血清(如牛胎兒血清)，所以該抗體中有少量的其它免疫球蛋白存在。但是，這一試管方法不能夠產(chǎn)生用于某些目的的大量抗體或抗體濃縮物，因?yàn)閱慰寺】贵w的濃度僅約50微克/毫升。為了產(chǎn)生在量的純度稍底的單克隆抗體濃縮物，可以將所需的雜交瘤注射進(jìn)小鼠中，最好是同源或半同源小鼠。適當(dāng)培養(yǎng)一段時(shí)間后，雜交瘤將引起產(chǎn)生抗體的腫瘤的形成，導(dǎo)致宿主小鼠的血流和腹膜浸出液(腹水)中所需抗體的濃度增高(約為5～20毫克/毫升)。這一方法在文獻(xiàn)中已充分公開，它有特別的和嚴(yán)重的缺點(diǎn)。PEG作為融合劑已被越來越多的人所接受，因?yàn)槠浼兤芬子诘玫角以谒璧姆肿恿糠秶鷥?nèi)，并且與仙臺病毒比較起來它較容易操縱。但是，PEG有效的整個(gè)濃度范圍非常窄。最佳濃度是50±5%(重量/體積)。在這一濃度下，它表現(xiàn)出對將被融合和已經(jīng)融合了的所有細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)。另一方面，當(dāng)使用亞最佳濃度的PEG時(shí)，僅現(xiàn)定到適度的細(xì)胞毒性，但是融合效率以及其后的雜交瘤形成都很低。與仙臺病毒相比，已知的化學(xué)融合劑如PEG和電-融合不影響被融合的細(xì)胞的凝集，因此，細(xì)胞膜在緊密貼近處對融合并非直接有效。因此，本專利技術(shù)的目的之一就是提供能夠產(chǎn)生有用產(chǎn)物的新型融合雜交細(xì)胞。本專利技術(shù)的目的之二是發(fā)展一種制備雜交細(xì)胞的方法，它是將能夠產(chǎn)生有用產(chǎn)物的哺乳動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞(如胰島細(xì)胞)與能夠連續(xù)繁殖的合適的融合配偶體進(jìn)行融合。本專利技術(shù)的目的之三是要減少常規(guī)的化學(xué)融合劑的細(xì)胞毒作用，這些融合劑包括PEG、溶血卵磷脂、葡聚糖、DMSO(二甲基亞砜)、聚乙烯醇、聚-L-鳥氨酸以及已知有用的鹽如硝酸鈉或其組合物。在融合方法中，這將導(dǎo)致產(chǎn)生高產(chǎn)量的所需的雜環(huán)交細(xì)胞。本專利技術(shù)的目的之四是產(chǎn)生將被電-融合技術(shù)融合的凝聚細(xì)胞。這些目的以及其它目的將在以下的敘述中清楚可見。從總體上講，本專利技術(shù)涉及能夠產(chǎn)生有用產(chǎn)物的融合雜交細(xì)胞，它是將非抗體產(chǎn)生哺乳動(dòng)物細(xì)胞與一種能夠連續(xù)繁殖的哺乳動(dòng)物細(xì)胞融合而得到的，所說的融合通過首先一起凝聚然后影響凝聚細(xì)胞的融合而被簡化。從總體上講，本專利技術(shù)的另一個(gè)方面涉及植物細(xì)胞的凝聚和融合，以產(chǎn)生能夠產(chǎn)生有用產(chǎn)物的雜交細(xì)胞。本專利技術(shù)涉及制備一個(gè)融合雜交細(xì)胞的方法，它是在選擇性條件下將能夠產(chǎn)生有用產(chǎn)物的非抗體產(chǎn)生的哺乳動(dòng)物細(xì)胞與能夠連續(xù)繁殖的哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行融合，它包括將被融合的細(xì)胞混合物與有效量的凝聚原接觸，然后進(jìn)行凝聚細(xì)胞的融合。在另一方面，本專利技術(shù)涉及植物細(xì)胞的凝聚和融合以產(chǎn)生能夠產(chǎn)生有用產(chǎn)物的雜交細(xì)胞。本專利技術(shù)進(jìn)一步涉及制備融合雜交細(xì)胞的方法，它包括將能夠產(chǎn)生有用產(chǎn)物的植物細(xì)胞和能夠連續(xù)繁殖的植物細(xì)胞與有效量的凝聚原接觸，然后進(jìn)行凝聚細(xì)胞的融合。本專利技術(shù)的另一方面是采用已知融合技術(shù)將能夠產(chǎn)生有用產(chǎn)物的植物細(xì)胞的原生質(zhì)體與能夠連續(xù)繁殖的細(xì)胞(如根癌細(xì)胞)的原生質(zhì)體進(jìn)行融合，它借助或未借助預(yù)先或伴隨的凝聚作用的幫助，這些雜交細(xì)胞具有產(chǎn)生所需的有用產(chǎn)物的能力。“凝集原”是一個(gè)用于描述任何具有凝集被融合細(xì)胞的能力的試劑的術(shù)語。雖然它包括所有的凝集原，但典型的凝集原是植物凝集素(PHA)、伴刀豆球蛋白A和花生凝集素。本專利技術(shù)優(yōu)選的凝集原是PHA。凝集原的濃度應(yīng)進(jìn)行調(diào)整，使得觀察不到細(xì)胞毒性作用，而發(fā)生明顯程度的凝集作用。凝集原PHA的適當(dāng)范圍是25～400微克/毫升。較好的PHA濃度為約150～200微克/毫升，最好是200微克/毫升。其它凝集原的合適濃度可以采用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)很容易地被確定。凝集作用是在生理溫度(如37℃)下經(jīng)過足夠長時(shí)間(如5～15分鐘)的處理而進(jìn)行的。充分凝集后，就可進(jìn)行細(xì)胞的融合。在一實(shí)施方案中，首先加入常規(guī)的化學(xué)融合劑(最好是PEG)，然后在生理?xiàng)l件下培養(yǎng)混合物，實(shí)現(xiàn)凝集細(xì)胞的融合。當(dāng)使用PEG時(shí)，其濃度為約30～50%(重量/體積)。優(yōu)選的PEG的濃度約為40±5%(重量/體積)。最佳融合時(shí)間約為1分鐘。時(shí)間也可以更長，特別情況下達(dá)到2分鐘以上，但隨著時(shí)間的增加，存在著細(xì)胞毒性增加的危險(xiǎn)。在另一實(shí)施方案中，凝集細(xì)胞的融合是通過電-融合實(shí)現(xiàn)的。與以前技術(shù)所產(chǎn)生的結(jié)果相比，本專利技術(shù)的這一新型融合技術(shù)導(dǎo)致形成的能存活雜交細(xì)胞明顯增加。術(shù)語“有用產(chǎn)物”包括被融合的哺乳動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞可以產(chǎn)生的所有產(chǎn)物。典型的例子有生物活性蛋白、糖蛋白、多肽、酶和非蛋白質(zhì)化合物，如生物堿、甾類、薯蕷皂苷配基、蒽醌、除蟲菊酯、芳香油、多糖、強(qiáng)心苷、香料和美發(fā)油成分。能夠由被融合的細(xì)胞產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)的典型例子如下面的表Ⅰ至Ⅴ所示。表1生物堿 殺蟲劑變應(yīng)原 本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種能夠產(chǎn)生有用產(chǎn)物的融合雜交細(xì)胞，它是通過非抗體產(chǎn)生哺乳動(dòng)物細(xì)胞與能夠連續(xù)繁殖的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的融合而得到的，所說的融合是通過首先引起凝聚然后進(jìn)行凝聚細(xì)胞的融合而促進(jìn)的。

【技術(shù)特征摘要】
US 1986-6-24 8780921.一種能夠產(chǎn)生有用產(chǎn)物的融合雜交細(xì)胞，它是通過非抗體產(chǎn)生哺乳動(dòng)物細(xì)胞與能夠連續(xù)繁殖的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的融合而得到的，所說的融合是通過首先引起凝聚然后進(jìn)行凝聚細(xì)胞的融合而促進(jìn)的。2.一種能夠產(chǎn)生有用產(chǎn)物的融合雜交細(xì)胞，它是通過一種植物細(xì)胞與一種能夠連續(xù)繁殖的植物細(xì)胞的融合而得到的，所說的融合通過首先引入起凝聚，然后進(jìn)行凝聚細(xì)胞的融合而促進(jìn)的。3.由權(quán)利要求1或2的雜交細(xì)胞所產(chǎn)生的有用產(chǎn)物。4.一種制備雜交細(xì)胞的方法，它是在融合并在選擇條件下將非抗體產(chǎn)生的哺乳動(dòng)物細(xì)胞與能夠連續(xù)繁殖的哺乳動(dòng)物細(xì)胞融合而得到的，這一方法包括將被融合的細(xì)胞混合物與有效量的凝聚原相接觸，然后進(jìn)行凝聚細(xì)胞的融合。5.一種制備融合雜交細(xì)胞的方法，它包括將能夠產(chǎn)生有用產(chǎn)物的植物細(xì)胞和能夠連續(xù)繁殖的植物細(xì)胞與有效的凝集原接觸，然后進(jìn)行凝集細(xì)胞的融合。6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于凝聚原是植物血球凝聚素。7.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于其融合為化學(xué)融合。8.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于其融合為電-融合。9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于其融合劑是平均分子量為1000至4000的PEG。10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于能夠連續(xù)繁殖的植物細(xì)胞是根癌細(xì)胞。11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中連續(xù)繁殖的細(xì)胞是骨髓瘤細(xì)胞。12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的能夠產(chǎn)生胰島素的融合雜交細(xì)胞，所說的細(xì)胞是胰島細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的融合產(chǎn)物。13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的能夠產(chǎn)生胰高血糖素的融合雜交細(xì)胞，所說的細(xì)胞是胰島細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合產(chǎn)物。14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的能夠產(chǎn)生生長激素抑制素的融合雜交細(xì)胞，所說的細(xì)胞是胰島細(xì)胞與骨髓細(xì)胞的融合產(chǎn)物。15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的能夠產(chǎn)生ACTH的融合雜交細(xì)胞，所說的細(xì)胞是垂體前葉細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合產(chǎn)物。16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的能夠產(chǎn)生促黃體生成激素的融合雜交細(xì)胞，所說的細(xì)胞是垂體細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合產(chǎn)物。17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的能夠產(chǎn)生促濾泡素的融合雜交細(xì)胞，所說的細(xì)胞是垂體細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合產(chǎn)物。18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的能夠產(chǎn)生生長激素的融合雜交細(xì)胞，所說的細(xì)胞是垂體細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合產(chǎn)物。19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的能夠產(chǎn)生LH-RH(黃體生成素釋放激素)的融合雜交細(xì)胞，所說的細(xì)胞是垂體細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合產(chǎn)物。20.根據(jù)權(quán)利要求1所述的能夠產(chǎn)生促乳素的融合雜交細(xì)胞，所說的細(xì)胞是垂體細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合產(chǎn)物。21.根據(jù)權(quán)利要求1所述的能夠產(chǎn)生促甲狀腺素(TSH)的融合雜交細(xì)胞，所說的細(xì)胞是垂體細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合產(chǎn)物。22.根據(jù)權(quán)利要求1所述的能夠產(chǎn)生胸腺激素的融合雜交細(xì)胞，所說的細(xì)胞是胸腺細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合產(chǎn)物。23.根據(jù)權(quán)利要求1所述的能夠產(chǎn)生紅血球生成素的融合雜交細(xì)胞，所說的細(xì)胞是腎細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合產(chǎn)物。24.根據(jù)權(quán)利要求1所述的能夠產(chǎn)生表皮生長因子的融合雜交細(xì)胞，所說的細(xì)胞是頜下腺細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合產(chǎn)物。25.根據(jù)權(quán)利...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：賽P三卡拉，
申請(專利權(quán))人：默里爾多藥物公司，
類型：發(fā)明
國別省市：US[美國]