在制備多肽的方法中有效的真菌轉錄激活因子技術

本發明專利技術涉及分離的核酸序列，其編碼具有轉錄激活活性的多肽，同時本發明專利技術涉及所述的多肽。本發明專利技術還涉及包括所述核酸序列的核酸構建體、載體以及宿主細胞。本發明專利技術進一步涉及有效用于制備所述多肽的宿主細胞，在所述的宿主細胞中轉錄激活因子的產生或功能被改變，本發明專利技術還涉及用于制備所述多肽的方法。（*該技術在2021年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及分離的核酸序列，其編碼具有轉錄激活活性的多肽，本專利技術還涉及所述的多肽。本專利技術還涉及包括所述核酸序列的核酸構建體、載體以及宿主細胞。本專利技術進一步涉及有效用于制備所述多肽的宿主細胞，在所述的宿主細胞中轉錄激活因子的產生或功能被改變，本專利技術還涉及用于制備所述多肽的方法。
技術介紹
近年來，重組宿主細胞在異源蛋白表達中的應用大大簡化了商品化蛋白的大量制備，否則只有通過從其天然來源中純化才能獲得所述的蛋白。目前，可以選擇不同的表達系統，包括細菌和真核宿主，從所述的系統中選擇用于制備任何特定蛋白。對適當表達系統的選擇通常不僅有賴于宿主細胞在活躍狀態產生足夠產量蛋白的能力，而且在很大程度上也可能由所述蛋白預期的最終用途決定。經常遇到的一個問題是由特定宿主細胞產生的或存在于培養基中的高水平的蛋白水解酶。一個建議是提供失去了產生特異性蛋白水解化合物能力的宿主生物體。例如，WO 90/00192(Genencor，Inc.)描述了不能分泌有酶活性的天冬氨酸蛋白酶的絲狀真菌宿主。EP 574 347(Ciba Geigy AG)描述了枯草桿菌蛋白酶型的絲氨酸蛋白酶缺陷的曲霉宿主。WO 98/12300(NovoNordisk A/S)描述了金屬蛋白酶以及堿性蛋白酶缺陷的宿主。WO97/12045(Genencor，Inc.)描述了由于參與蛋白酶基因調節的啟動子序列的破壞而導致造成蛋白酶缺陷的酵母和細菌宿主系統。Mattem，I.E.等，(1992.分子和普通遺傳學(Mol Gen Genet)234332-336)描述了黑曲霉的一個突變株，其被表明僅僅具有親代菌株1％到2％的細胞外蛋白酶活性，這顯然是由于至少兩種蛋白酶曲霉胃蛋白酶A(aspergillopepsinA)和曲霉胃蛋白酶B(aspergillopepsin B)的缺陷。提示蛋白酶缺陷表型可能由影響編碼兩種蛋白酶基因表達的調控性突變造成。真核轉錄在一個特定啟動子或一組啟動子處的起始需要一種真核轉錄激活因子，其為一種多肽，但其本身不是RNA聚合酶的一部分。許多轉錄激活因子結合至啟動子上的特定位點形成起始該多肽編碼序列的轉錄所需的一種功能性啟動子。然而，只有在其他多肽存在下，轉錄激活因子也可以被并入一種轉錄起始復合物。對真菌中具有轉錄激活活性的多肽已經進行了描述，而且已公開了此類多肽的名單(Dhawale，S.S.，和Lane，A.C.1993.核酸研究(Nucleic Acid Research)215537-5546)。本專利技術建議的解決方法本專利技術的一個目的是提供改進的方法用于在宿主細胞中增加多肽的產生，在所述的宿主細胞中參與調節蛋白酶產生的轉錄激活因子的活性被改進。專利技術簡述本專利技術的一個方面涉及一種分離的編碼轉錄激活因子的核酸序列，其選自(a)與SEQ ID NO1或SEQ ID NO48的核酸序列有至少70％同一性的核酸序列；(b)編碼一種多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列與SEQ ID NO2或SEQ ID NO49的氨基酸序列有至少50％的同一性。(c)在低嚴謹度條件下與(i)SEQ ID NO1或SEQ ID NO48的核酸序列，或者(ii)其互補鏈雜交的核酸序列，其中將低嚴謹度條件定義為于42℃在5×SSPE、0.3％SDS、200μg/ml剪切并變性的鮭魚精DNA和25％甲酰胺中預雜交和雜交，并將洗滌條件定義為于50℃在2×SSC、0.2％SDS中洗滌30分鐘；(d)(a)、(b)或(c)的等位基因變體；(e)(a)、(b)、(c)或(d)的亞序列，其中該亞序列編碼一種具有轉錄激活活性的多肽片段；以及(f)(a)、(b)、(c)或(d)的亞序列，其中該亞序列編碼一種具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的多肽。表示為SEQ ID NO1的核酸序列是黑曲霉(Aspergillus niger)prtT基因，其編碼在下面所述和實施例中的表示為SEQ ID NO2的轉錄因子。表示為SEQ ID NO48的核酸序列是米曲霉(Aspergillus oryzae)IFO4177prtT基因，其編碼SEQ ID NO49所示的轉錄因子。米曲霉prtT基因具有一個以795位點開始的編碼區，并以2931位點結束。所述prtT基因分別在位點1028-1135，1538-1591，2018-2066，和2297-2347具有4個內含子。下文和實施例中對此進行詳述。在另一方面，本專利技術還涉及包括所述核酸序列的核酸構建體、載體和宿主細胞，以及由所述核酸序列編碼的多肽。本專利技術進一步涉及可用于制備多肽的宿主細胞，在所述的宿主細胞中轉錄激活因子的產生或功能被改變，本專利技術還涉及用于制備所述多肽的方法。附圖簡述附圖說明圖1顯示質粒pPAP的限制性圖譜，其構建過程在實施例1中描述。圖2顯示質粒pAopyrGcosArp1的限制性圖譜，其構建過程在實施例1中描述。圖3顯示質粒pEES1的限制性圖譜，其構建過程在實施例1中描述。圖4顯示質粒pDprt的限制性圖譜，其構建過程在實施例3中描述。圖5顯示質粒pGPprt的限制性圖譜，其構建過程在實施例4中描述。圖6顯示在包含米曲霉prtT Zn2+-指狀結構的PCR片段的兩個質粒插入的序列。ICA217是來自于其中一個質粒的序列，ICA218是另一個的。圖7顯示了基于pSP65(PromegTM)的質粒pDV8，其包含一個在1.2kbBglII/BamHI片段上的HSV-tk基因，所述基因插入到構巢曲霉(A.nidulans)gpd啟動子的1.0kb XhoI/BglII片段和含有構巢曲霉trpC轉錄終止子0.8kb BamHI/HindIII片段之間。圖8顯示了實施例8所述的pJaL554的構建。專利技術詳述編碼轉錄激活因子的核酸序列本專利技術一方面涉及一種分離的編碼轉錄激活因子的核酸序列，其選自(a)與SEQ ID NO1或SEQ ID NO48的核酸序列有至少70％同一性的核酸序列；(b)編碼一種多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列具有與SEQ IDNO2或SEQ ID NO49的氨基酸序列有至少50％同一性。(c)在低嚴謹度條件下與(i)SEQ ID NO1或SEQ ID NO48的核酸序列，或者(ii)其互補鏈雜交的核酸序列，其中將低嚴謹度條件定義為于42℃在5×SSPE、0.3％SDS、200μg/ml剪切并變性的鮭魚精DNA和25％甲酰胺中預雜交和雜交，并將洗滌條件定義為于50℃在2×SSC、0.2％SDS中洗滌30分鐘；(d)(a)、(b)或(c)的等位基因變體；(e)(a)、(b)、(c)或(d)的亞序列，其中該亞序列編碼一種具有轉錄激活活性的多肽片段；以及(f)(a)、(b)、(c)或(d)的亞序列，其中該亞序列編碼一種具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的多肽。本文中所用的術語“轉錄激活因子”指能激活一個特定啟動子或一組啟動子的多肽，所述的啟動子是其連接的多肽編碼序列轉錄起始所必需的。本文中所用的術語“分離的核酸序列”指一種基本上沒有其他核酸序列的核酸序列，例如通過瓊脂糖電泳測定純度為至少大約20％，優選至少大約40％，更優選至少大約60％，甚至更優選至少大約80％，最優選至少大約90％。例如，分離的本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種分離的核酸序列，其編碼一種具有轉錄激活活性的多肽，其選自： （ａ）與ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１或ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８的核酸序列有至少７０％的同一性的核酸序列； （ｂ）編碼一種多肽的核酸序列，所述多肽具有與ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２或ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９的氨基酸序列至少５０％的同一性的氨基酸序列。 （ｃ）在低嚴謹度條件下與（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１或ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８的核酸序列，或者（ｉｉ）其互補鏈雜交的核酸序列，其中將低嚴謹度條件定義為于４２℃在５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００μｇ／ｍｌ剪切并變性的鮭魚精ＤＮＡ和２５％甲酰胺中預雜交和雜交，并將洗滌條件定義為于５０℃在２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ中洗滌３０分鐘； （ｄ）（ａ）、（ｂ）或（ｃ）的等位基因變體； （ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）或（ｄ）的亞序列，其中該亞序列編碼一種具有轉錄激活活性的多肽片段；以及 （ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）或（ｄ）的亞序列，其中該亞序列編碼一種具有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３的氨基酸序列的多肽。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：卡斯滕M約爾特，CMJJ范登杭德爾，PJ龐特，FHJ舒倫，托夫克里斯坦森，
申請(專利權)人：諾維信公司，
類型：發明
國別省市：DK[丹麥]