一種落葉松植物離體發生的方法技術

本發明專利技術提供了一種落葉松植物高效離體發生的方法，具體地，本發明專利技術首次發現對落葉松植物實生苗的下胚軸為起始外植體，進行離體繁殖，可誘導出含有許多胚性細胞的愈傷組織，并可進一步高效誘導不定芽的發生,并經過不定芽的伸長、生根及移栽成苗后，可獲得大量再生植株表型一致性高、遺傳穩定性好的落葉松植物，此外，還可以作為體細胞雜交的親本之一，進行細胞雜交，可創造不同于原親本的落葉松新種質。

Method for efficient generation of Larch plants in vitro

The present invention provides a method for efficient plant from larch, the body, the invention first found on larch seedling plant seedling hypocotyl as initial explants, for in vitro propagation, can induce embryogenic cells containing many callus, and further efficient adventitious bud induction, and after shoot elongation, rooting and transplanting, can obtain a large number of regenerated plants phenotype of high consistency and good genetic stability of Larch plants, in addition, can also be used as one of the parents of somatic hybridization, cell hybridization, create new germplasm is different from the original parent larch.

【技術實現步驟摘要】
一種落葉松植物高效離體發生的方法
本專利技術涉及落葉松植物栽培領域，具體涉及一種落葉松植物高效離體發生的方法。
技術介紹
落葉松(LarixMill)屬松科(Pinaceae)落葉松亞科(Laricoideae)，天然分布在北半球溫帶山區、寒溫帶的平原及高山氣候區。落葉松具有分布廣泛、適應性強、病蟲害少、材質優良等特點，其早期速生性在所有的針葉樹中位居前列，是國營林場和農民都非常重視的造林樹種，人工造林面積目益擴大；也是我國東北、西北、華北及南方亞高山地區的重要紙漿材及建筑材樹種。但落葉松生長周期較長，有性繁殖后代變異較大，且扦插繁殖生根率很低。組織培養作為落葉松快速無性繁殖的主要途徑，存在著很大潛力。因此，開展落葉松的高效離體發生研究具有重要意義。作為基本的技術操作平臺，落葉松的離體再生系統具有以下主要用途：(1)種苗提供常規方法生產落葉松種子耗時費力，單位時間內生產效率低下，種子園的種子產量受氣候與栽培管理方式影響較大，年度間產量極不穩定，種子供應不足，種苗整齊度呈現正態分布。使用高效的離體再生系統，對優良母株進行無性擴繁，為無性系林業育種提供技術支撐。(2)品種改良目前，我國主要通過人工引種、良種選育、種間雜交等傳統育種方式對落葉松進行遺傳改良。雖然在此領域已取得了令人矚目的進展，然而從技術層面上來說，由于這些傳統的育種方式人力、物力耗費較大、受自然條件影響、育種周期長、遺傳操作難度大，落葉松育種進程不能滿足現代林木遺傳育種的需要。因此，本領域迫切需要開發一種新型的、可以實現落葉松植物的大規模種植的高效離體發生的方法。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種新型的、可以實現落葉松植物的大規模種植的高效離體發生的方法。本專利技術第一方面提供了一種落葉松植物的繁殖方法，包括步驟：(a)對所述落葉松植物的種子進行萌發處理，從而獲得經萌發的種苗；(b)對所述經萌發的種苗培養n天，其中n為4-20，從而獲得經培養的實生苗；(c)對所述實生苗的下胚軸進行切取，獲得下胚軸切段，所述下胚軸切段的長度為1-6mm；和(d)對所述的下胚軸切段進行再生，從而獲得落葉松植物植株。在另一優選例中，在步驟(b)中，從出苗日當天起培養4-20天。在另一優選例中，所述步驟(b)中，將所述種苗進行培養5-18天，較佳地，6-16天。在另一優選例中，在步驟(d)中，包括以下一個或多個獨立的子步驟：(d1)對所述的下胚軸切段進行培養，獲得愈傷組織；(d2)對所述愈傷組織進行出芽處理，從而獲得原始不定芽(即，芽原基)；(d3)對所述原始不定芽進行培養，從而獲得伸長的不定芽；(d4)對所述伸長的不定芽進行生根處理，從而獲得落葉松植物植株。在另一優選例中，所述步驟(c)中，所述下胚軸切段的長度為1-5mm，較佳地，2-4mm。在另一優選例中，所述步驟(b)中，還包括對所述實生苗進行消毒的步驟。在另一優選例中，所述步驟(d)中，所述再生在低氮和/或低NH4+的培養基中進行。在另一優選例中，所述的低氮和/或低NH4+的培養基是基于MS培養基的低氮和/或低NH4+的培養基。在另一優選例中，在所述低氮和/或低NH4+的培養基中，除了氮和/或NH4+之外的其他成分和含量與MS培養基基本相同(例如對于任一其他成分而言，為標準MS培養基中同一成分含量的約80-130％，較佳地90-120％)。在另一優選例中，所述子步驟(d1)、(d2)、(d3)和/或(d4)的一個或多個(或全部)中，所述再生在低氮、低NH4+的培養基中進行。在另一優選例中，所述的“低氮”指所述培養基或培養條件的氮含量NL與MS培養基中氮含量N0之比(NL/N0)為0.3-0.9，較佳地0.35-0.8，更佳地0.3-0.6。在另一優選例中，所述的“低NH4+”指所述培養基或培養條件的NH4+含量ML與MS培養基中NH4+含量M0之比(ML/M0)為0.2-0.7，較佳地0.25-0.6，更佳地0.3-0.5。在另一優選例中，所述步驟(d)中，所述培養基為以MS培養基為基礎，且氮含量(濃度)為MS培養基中氮含量的1/4-1/2，較佳地，1/3-1/2。在另一優選例中，所述培養基含有NH4Cl、NH4NO3和KNO3。在另一優選例中，所述步驟(d)或其一個或多個子步驟中，所述培養基中，NH4Cl的濃度為300-650mg/l，較佳地，400-600mg/l。在另一優選例中，所述步驟(d)或其一個或多個子步驟中，所述培養基中，NH4NO3的濃度為400-700mg/l，較佳地，500-650mg/l。在另一優選例中，所述步驟(d)或其一個或多個子步驟中，所述培養基中，KNO3的濃度為600-1000mg/l，較佳地，700-900mg/l。在另一優選例中，所述步驟(d)或其一個或多個子步驟中，所述培養基中，以Ca(NO3)2·2H2O的質量計，Ca(NO3)2·2H2O的濃度為400-800mg/l，較佳地，500-700mg/l。在另一優選例中，所述步驟(d1)中，將所述下胚軸切段置于含0.08-20mg/l(較佳地，0.1-10mg/l，更佳地，0.3-8mg/l，最佳地，0.5-3mg/l)BA和0.01-5mg/l(較佳地，0.05-3mg/l，更佳地，0.08-1mg/l，最佳地，0.1-0.5mg/l)NAA的培養基上，于23±1℃培養，所述下胚軸的近子葉端開始膨大，獲得愈傷組織。在另一優選例中，所述步驟(d2)中，將所述愈傷組織置于含0.05-10mg/l(較佳地，0.08-8mg/l，更佳地，0.1-5mg/l，)BA和0.01-5mg/l(較佳地，0.05-3mg/l，更佳地，0.08-1mg/l)NAA的培養基上，于23±1℃培養8-12周，獲得原始不定芽，即芽原基。在另一優選例中，所述步驟(d3)中，將所述帶有原始不定芽(即芽原基)的愈傷組織置于含0.05-10mg/l(較佳地，0.08-8mg/l，更佳地，0.1-6mg/l)BA，0-0.1mg/l(較佳地，0.001-0.08mg/l，更佳地，0.005-0.05mg/l)TDZ和0.01-5mg/l(較佳地，0.05-3mg/l，更佳地，0.08-1mg/l)NAA的培養基上培養6-8周，于23±1℃培養，誘導出形態清晰的不定芽。在另一優選例中，所述步驟(d4)中，將所述伸長的不定芽置于含有0-6mg/l(較佳地，0.01-3mg/l，更佳地，0.05-1mg/l，最佳地，0.1-0.6mg/l)BA、0-0.6mg/l(較佳地，0.01-0.5mg/l，更佳地，0.001-0.4mg/l，最佳地，0.002-0.2mg/l)NAA和0-6mg/l(較佳地，0.01-4mg/l，更佳地，0.05-3mg/l，最佳地，0.1-2mg/l)GA3的培養基上，于22±1℃進行暗培養2-8天(較佳地3-7天)。在另一優選例中，所述步驟(d4)中，將所述暗培養后的不定芽(較佳地，分離的單株不定芽)，去除形態學下端葉片，用5-100mg/l(較佳地，10-80mg/l，更佳地，20-60mg/l)IBA預處理0.2-36h(較佳地0.5-24h)。在另一優選例中，所述步驟(d4)中，所述預處理后的不定芽(較佳地，分離的單本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種落葉松植物的繁殖方法，其特征在于，包括步驟：(a)對所述落葉松植物的種子進行萌發處理，從而獲得經萌發的種苗；(b)對所述經萌發的種苗培養n天，其中n為4?20，從而獲得經培養的實生苗；(c)對所述實生苗的下胚軸進行切取，獲得下胚軸切段，所述下胚軸切段的長度為1?6mm；和(d)對所述的下胚軸切段進行再生，從而獲得落葉松植物植株。

【技術特征摘要】
1.一種落葉松植物的繁殖方法，其特征在于，包括步驟：(a)對所述落葉松植物的種子進行萌發處理，從而獲得經萌發的種苗；(b)對所述經萌發的種苗培養n天，其中n為4-20，從而獲得經培養的實生苗；(c)對所述實生苗的下胚軸進行切取，獲得下胚軸切段，所述下胚軸切段的長度為1-6mm；和(d)對所述的下胚軸切段進行再生，從而獲得落葉松植物植株。2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(d)中，包括以下一個或多個獨立的子步驟：(d1)對所述的下胚軸切段進行培養，獲得愈傷組織；(d2)對所述愈傷組織進行出芽處理，從而獲得原始不定芽(即，芽原基)；(d3)對所述原始不定芽進行培養，從而獲得伸長的不定芽；(d4)對所述伸長的不定芽進行生根處理，從而獲得落葉松植物植株。3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(c)中，所述下胚軸切段的長度為1-5mm，較佳地，2-4mm。4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(d)中，所述再生在低氮和/或低NH4+的培養基中進行。5.如權利...

【專利技術屬性】
技術研發人員：朱木蘭，衛志明，鄭武林，劉航，
申請(專利權)人：中國科學院上海生命科學研究院，
類型：發明
國別省市：上海,31