一種提取細菌外排膜囊泡的方法技術

本發明專利技術公開了一種利用超濾濃縮法得到大腸桿菌和肺炎克雷伯桿菌外膜囊泡的方法，包括：將大腸桿菌和肺炎克雷伯桿菌制成菌懸液，取適量菌懸液接種于含有培養基的試管中培養過夜，再取適量菌液接種于含有l培養基的搖瓶中培養OD值接近1.0，收集菌液，離心除去菌體，無菌濾頭過濾除去殘余菌體，收集濾液，用截留分子量為100KDa的超濾管離心濃縮至原體積的1/8，加生理鹽水洗滌并重復2～3次，收集處于超濾管上層的細菌外膜囊泡，置-20℃環境分裝凍存，提取的肺炎克雷伯桿菌外膜囊泡蛋白濃度為1.5mg/ml，大腸桿菌的外膜囊泡蛋白濃度2.1mg/ml，OMVs粒徑為20～100nm左右。本方法操作方便、簡單易行，為OMVs的提取、研究提供了新方法。

【技術實現步驟摘要】
一種提取細菌外排膜囊泡的方法
本專利技術涉及一種利用超濾濃縮法制備大腸桿菌(DH5α)和肺炎克雷伯桿菌(klebsiellapneumoniae，KP)外排膜囊泡(bacterialoutermembranevesicles，OMVs)的方法。
技術介紹
據報道，細菌外膜囊泡是從革蘭氏陰性菌表面以出芽的形式連續釋放的雙層球形蛋白脂質體，直徑一般為20-250nm，通常攜帶細菌外膜和周質組分，包括一些DNA、RNA、內毒素(LPS)，蛋白質，酶和肽聚糖等，其結構如圖1所示；臨床研究表明，OMVs能夠引起機體的炎癥和病理學反應，OMVs與很多傳染性疾病相關，如牙周炎、胃炎、科隆氏病、輸卵管炎、腦膜炎、膿毒癥、心血管疾病以及肺部疾病等，OMVs越來越受到研究者們的關注。研究顯示，OMVs本身具有一些固有的特性，如能夠產生與母體類似的具有免疫原性的表面和膜相關組分，能夠增強抗體和T細胞對抗原的應答，常被用來制作疫苗；實驗已表明，它在不同的溫度和處理條件下非常穩定，而且屬于非復制型疫苗，有報道公開了經過基因工程修飾得到的OMVs能夠選擇性的表達相應的抗原，減少內毒性，被廣泛應用。近年來，來源于細菌、病毒、哺乳動物細胞等的生物納米載體作為藥物遞送系統受到廣泛關注和研究，這些生物來源的納米載體具有生物可降解性、能夠逃避宿主免疫反應、能夠攜帶不同的治療藥物(如化療藥物和siRNA等)到特定的靶位點等優點，OMVs亦作為這樣一種生物納米載體被廣泛用于藥物遞送的研究(Kaparakis-LiaskosM,FerreroRL(2015)Immunemodulationbybacterialoutermembranevesicles.NatureReviewsImmunology15(6):375-387doi:10.1038/nri3837.SchwechheimerC,KuehnMJ(2015)Outer-membranevesiclesfromGram-negativebacteria:biogenesisandfunctions.NatureReviewsMicrobiology13(10):605-619doi:10.1038/nrmicro3525.)。目前對OMVs的提取方法主要有蔗糖密度梯度離心法和Optiprep密度梯度離心法，但，實踐顯示，所述的此兩種方法操作繁瑣，后期處理較麻煩。鑒于此，本申請的專利技術人擬提供一種操作方便、簡單易行的提取細菌外排膜囊泡(OMVs)的方法。
技術實現思路
本專利技術的目的是克服現有技術的缺陷與不足，提供一種操作方便、簡單易行的提取細菌外排膜囊泡(OMVs)的方法。本專利技術利用超濾濃縮法，在此基礎上加生理鹽水清洗OMVS，除掉多余的雜蛋白和鞭毛菌毛等雜質，獲得較純凈的提取物，本專利技術方法較密度梯度離心法操作方便、簡單易行，為OMVs的提取、研究提供了新方法。本專利技術的提取細菌外排膜囊泡(OMVs)的方法，利用超濾濃縮法得到大腸桿菌和肺炎克雷伯桿菌外膜囊泡，主要包括：將大腸桿菌和肺炎克雷伯桿菌制成菌懸液，取適量菌懸液接種于含培養基的試管中培養過夜，再取適量菌液接種于含培養基的搖瓶中培養OD值接近1.0，收集菌液，離心除去菌體，無菌濾頭過濾除去殘余菌體，收集濾液，用截留分子量為100KDa的超濾管離心濃縮至原體積的1/8，加生理鹽水洗滌并重復此步驟重復2～3次，收集處于超濾管上層的細菌外膜囊泡，置-20℃環境分裝凍存。本專利技術中，所述的大腸桿菌DH5α來源于美國菌種保藏中心，肺炎克雷伯桿菌來源于中國農業微生物菌種保藏中心。更具體的，本專利技術的提取細菌外排膜囊泡(OMVs)的方法，其包括：首先選取兩株革蘭氏陰性菌，肺炎克雷伯桿菌和大腸桿菌DH5α，分別用NB培養基和LB培養基培養至OD值達到1.0，采用高速離心法離心除去菌體，再用0.22μM無菌濾膜過濾徹底除菌，將培養基轉移至超濾濃縮管濃縮至原體積的1/8，用生理鹽水洗滌2～3次，得到較純凈的OMVs，透射電子顯微鏡下觀察OMVs形態，SDS-PAGD凝膠電泳觀察OMVs含有的蛋白量及分子量；BCA法測提取的肺炎克雷伯桿菌外膜囊泡蛋白濃度約為1.5mg/ml，大腸桿菌的外膜囊泡蛋白濃度約為2.1mg/ml，透射電子顯微下觀察OMVs粒徑約為20～100nm左右。本專利技術中，所述的OMVs是大腸桿菌和肺炎克雷伯桿菌表面以出芽的形式連續釋放的雙層球星蛋白脂質體，通常攜帶細菌外膜和周質成分。本專利技術中，將大腸桿菌和肺炎克雷伯桿菌制成菌懸液，先取10μL菌懸液于3ml培養基中(大腸桿菌在LB培養基中培養，肺炎克雷伯桿菌在NB培養基中培養)培養12h過夜，分別將試管菌液轉移至相應40ml培養基中培養，直至OD值達到1.0。本專利技術中，將菌液置于50ml離心管中，6000r/min離心20min，棄掉菌沉淀得到培養基上清液，再用0.22μM無菌濾頭過濾，得到無菌濾液。本專利技術中，將獲得的無菌濾液加入50ml的超濾管中，3000r/min離心，將OMVs截留在超濾管上部，重復離心，直至總體積濃縮為原體積的1/8，約5ml，經清洗后得到OMVs。本專利技術中，所述的清洗方法中包括，在蔗糖密度梯度離心得到的OMVs中加入5ml生理鹽水(0.9％NaCl溶液)，轉入超濾管中超濾濃縮，重復2-3次，得到純凈的OMV。本專利技術中獲得的細菌外膜囊泡，可進一步作為藥學上可接受的納米遞藥載體。以及進一步用于制備疫苗。本專利技術利用超濾濃縮法得到大腸桿菌和肺炎克雷伯桿菌外膜囊泡的方法，能獲得較純凈的提取物，提取的肺炎克雷伯桿菌外膜囊泡蛋白濃度約為1.5mg/ml，大腸桿菌的外膜囊泡蛋白濃度約為2.1mg/ml，透射電子顯微下觀察OMVs粒徑約為20～100nm左右；較現有技術密度梯度離心法操作方便、簡單易行，為OMVs的提取、有關研究工作提供了新方法。附圖說明圖1，肺炎克雷伯桿菌示意圖。圖2，肺炎克雷伯桿菌(左)和大腸桿菌菌落(右)圖。圖3，倒置顯微鏡下肺炎克雷伯桿菌(左)與大腸桿菌(右)形態圖。圖4，蛋白-吸光度標準曲線圖。圖5肺炎克雷伯桿菌(左)與大腸桿菌(右)OMVs電鏡圖。圖6SDS-PAGE電泳圖，其中，左圖為肺炎克雷伯桿菌OMVs，右圖為大腸桿菌OMVs。具體實施方式：實施例1：菌株的選擇與培養肺炎克雷伯桿菌購自中國農業微生物菌種保藏中心，大腸桿菌DH5α購自美國菌種保藏中心。肺炎克雷伯桿菌用NB培養基培養，大腸桿菌用LB培養基培養；將菌株凍干粉用無菌生理鹽水溶解，取適量于固體培養基上，37℃培養過夜至長處單菌落(如圖2所示)；挑單菌落于含有3ml液體培養基的試管中培養，于37℃、180r/min搖床培養過夜。第二天將3ml菌液轉移至含有40ml培養基的搖瓶中培養，直至菌體OD值達到1.0，圖3顯示了結晶紫染色后的菌體形態。實施例2：OMVs的提取將培養到OD值為1.0的菌液于50ml無菌離心管中6000r/min離心20min，除掉大部分菌體，上清液用0.22μM的無菌濾頭過濾徹底除菌，再將濾液轉移至50ml截留分子量為100KD的超濾管中，4℃溫度下3000r/min離心10min，重復幾次，直至溶液總體及濃縮為原來的1/8左右；在濃縮液中加入5ml生理鹽水，利用超本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種提取細菌外排膜囊泡的方法，其特征在于，采用超濾濃縮法從大腸桿菌DH5α和肺炎克雷伯桿菌菌液中提取細菌外膜囊泡(OMVs)，其包括：將大腸桿菌和肺炎克雷伯桿菌制成菌懸液，取適量菌懸液接種于含培養基的試管中培養過夜，再取適量菌液接種于含培養基的搖瓶中培養OD值接近1.0，收集菌液，離心除去菌體，無菌濾頭過濾除去殘余菌體，收集濾液，用截留分子量為100KDa的超濾管離心濃縮至原體積的1/8，加生理鹽水洗滌并重復此步驟重復2～3次，收集處于超濾管上層的細菌外膜囊泡，置?20℃環境分裝凍存。

【技術特征摘要】
1.一種提取細菌外排膜囊泡的方法，其特征在于，采用超濾濃縮法從大腸桿菌DH5α和肺炎克雷伯桿菌菌液中提取細菌外膜囊泡(OMVs)，其包括：將大腸桿菌和肺炎克雷伯桿菌制成菌懸液，取適量菌懸液接種于含培養基的試管中培養過夜，再取適量菌液接種于含培養基的搖瓶中培養OD值接近1.0，收集菌液，離心除去菌體，無菌濾頭過濾除去殘余菌體，收集濾液，用截留分子量為100KDa的超濾管離心濃縮至原體積的1/8，加生理鹽水洗滌并重復此步驟重復2～3次，收集處于超濾管上層的細菌外膜囊泡，置-20℃環境分裝凍存。2.如權利要求1所述的提取細菌外排膜囊泡的方法，其特征在于，所述的大腸桿菌DH5α來源于美國菌種保藏中心，肺炎克雷伯桿菌來源于中國農業微生物菌種保藏中心。3.如權利要求1所述的提取細菌外排膜囊泡的方法，其特征在于，所述的OMVs是大腸桿菌和肺炎克雷伯桿菌表面以出芽的形式連續釋放的雙層球星蛋白脂質體，攜帶細菌外膜和周質成分。4.如權利要求1所述的提取細菌外排膜囊泡的方法，其特征在于，所述的菌液，是指將大腸桿菌和肺炎克雷伯桿菌制成菌懸液，先取10μL菌懸液于3ml培養基中，其中，大腸桿菌在...

【專利技術屬性】
技術研發人員：葉麗，姜珊珊，王乾，馮美卿，
申請(專利權)人：復旦大學，
類型：發明
國別省市：上海,31