一種速溶無析出的凍干人纖維蛋白原制備工藝制造技術

本發明專利技術涉及人纖維蛋白原制備工藝領域，具體是一種速溶無析出的凍干人纖維蛋白原制備工藝，由5個工序組成，第一步，組分I沉淀的溶解與過濾；第二步，S/D病毒滅活；第三步，兩步低溫乙醇沉淀精制；第四步，凍干；第五步，干熱病毒滅活。本發明專利技術通過改進的纖原生產工藝，可以制備出速溶、無析出、無乳光、無蛋白顆粒的纖維蛋白原，由該工藝不僅可制備傳統靜脈注射用人纖維蛋白原，也可制備人纖維蛋白粘合劑中配伍的高濃度人纖維蛋白原。

Preparation process of instant freeze drying Human Fibrinogen without precipitation

The invention relates to a process for preparing the specific field of Human Fibrinogen, is a kind of instant precipitate free lyophilized Human Fibrinogen preparation technology, composition, by 5 steps the first step, was dissolved and filtered I precipitation; the second step, S/D virus inactivation; the third step, the two step cold ethanol precipitation refining; the fourth step, frozen dry; the fifth step, heat inactivated virus. The original fiber production process is improved, can be prepared without precipitation, no milk, instant light, no protein particles of fibrinogen, by this process not only can be prepared using Human Fibrinogen traditional intravenous injection, but also high concentration Human Fibrinogen preparation of fibrin adhesive in combination.

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬生物制藥領域，涉及血液制品的制備工藝，具體地說，是一種速溶無析出的凍干人纖維蛋白原制備工藝。
技術介紹
人纖維蛋白原(humanfibrinogen，簡稱纖原或Fg)是含2964個氨基酸的大分子糖蛋白，是一種由肝臟合成的具有凝血功能的蛋白質，它是人體十三種凝血因子中含量最大的一種凝血因子，又稱凝血因子I。人纖維蛋白原是一種在臨床上使用非常頻繁的血液制品，也是戰場上止血不可或缺的急救藥品，然而纖維蛋白原在臨床上一直處于供不應求狀態。特別是近年來，一種具有高效止血功能的外科用血液制品——人纖維蛋白粘合劑越來越受到醫生與患者的青睞，作為該藥品配伍之一的高濃度人纖維蛋白原的需求量大增，從而使該產品面臨更加短缺的局面。人纖維蛋白粘合劑所用的人纖維蛋白原與常規靜脈輸注的人纖維蛋白原有很大的不同，主要體現在前者具有很高的蛋白濃度，至少是后者(一般為2.5％)的二倍或者更高即5-7％。人纖維蛋白原制品最大的問題在于凍干粉復溶時間長且溶解時需在30-37℃的水浴中進行，另一個問題是容易析出變性蛋白且有蛋白顆粒懸浮，這給臨床使用帶來了不便，譬如必須提前從冰箱里取出置于水浴中，靜脈輸注時需配備過濾裝置。低濃度人纖維蛋白原尚且如此，高濃度人纖維蛋白原的復溶就更困難了。因此用常規的人纖維蛋白原生產工藝很難制備出合格的高濃度纖維蛋白原產品，為此，必須從工藝的源頭開始在各個環節包括原液的配方乃至最后的凍干工序均需采取針對性的措施。目前，制備人纖維蛋白原的原料主要有三種，一是冷沉淀(又稱冷膠)，其主要用途是制備人凝血因子FVIII的，因從血漿分離冷膠時，由于蛋白的共沉淀現象，血漿中的部分人纖維蛋白原及其它蛋白質一齊隨冷膠沉淀出來(其中的纖維蛋白原含量有限，僅占整個血漿Fg的很小比例)；二是組分I沉淀，該沉淀是在去冷膠血漿中加入一定濃度的乙醇并降溫后分離收集的沉淀，含有血漿中最大比例的Fg；三是冷膠與組分I共沉淀，即在融化血漿中加入一定濃度的乙醇并降溫后使冷膠與組分I一起沉淀。以冷膠為原料的纖原制備工藝，因原料里面所含Fg甚少，經過一系列操作步驟，層層損失，最后的得率非常有限，缺乏商業生產的價值；而以冷膠與組分I共沉淀為原料的纖原生產工藝，也存在如下的問題，首先，沉淀中含有8％的乙醇，對沉淀中的人凝血因子VIII的穩定性而言，是個很不利的因素，沉淀的儲存必須十分謹慎，保存時間不可過長，投料時必須特別當心乙醇對人凝血因子VIII的變性損傷作用，所以原料中乙醇的存在無疑對人凝血因子VIII的生產工藝提出了苛刻的要求；其次，由于沉淀中人凝血因子VIII的大量存在，對纖原的生產也帶來了隱患，因為纖原容易被激活而導致生產失敗，纖原激活的原因比較復雜，但凝血酶是其中最直接的原因，凝血酶是凝血酶原在Ca2+離子及其它凝血因子包括凝血因子VIII參與下經過一系列復雜的鏈式反應被激活的，所以在纖原的制備過程中，人凝血因子VIII的存在也是一個不利的因素，應盡可能在工藝的最初工序中就徹底地除去；另外，從纖原的制備工藝看，有的工藝工序繁多，尤其是溶解與沉淀反復進行，由此導致頻繁的升溫、降溫、添加乙醇、酸堿等操作，這些操作對蛋白而言都不同程度地對蛋白產生損傷，一旦操作中出現劇烈變化的情形，很可能就會導致最終產品產生乳光乃至析出及復溶時間過長等的原因。還有，過高追求纖原的純度，也是導致有些工藝程序繁多，生產周期過長的原因，不少實踐證明，過高的產品純度對穩定性反而不利，容易導致纖原析出。有些蛋白譬如白蛋白是著名的蛋白保護劑，也是一些生物制品如疫苗不可或缺的保護劑。所以，對于纖原制品而言，更應追求產品的穩定性、速溶性目標。
技術實現思路
本專利技術的目的在于克服目前傳統纖原制備工藝存在的一些不足和缺陷，提供一種新型的速溶、高濃度、無析出的凍干人纖維蛋白原生產工藝，由該工藝不僅可制備傳統靜脈注射用人纖維蛋白原，也可制備人纖維蛋白粘合劑中配伍的高濃度人纖維蛋白原。本專利技術提供一種速溶無析出的凍干人纖維蛋白原制備工藝，包括以下步驟：A)將組分I沉淀切碎，按1：10-20的稀釋比，投入緩沖液1中溶解，均勻攪拌1-2小時；B)用30SP深層濾芯(CUNO公司濾芯)串聯一只1.0μm的濾芯過濾懸浮液；用上述緩沖液1后洗濾芯，收集濾液；C)在濾液中加入S/D母液；D)將S/D溶液降溫至-1℃左右，用噴霧方式緩慢加入低溫乙醇(不高于-20℃)至乙醇濃度為8-10％(V/V)；攪拌1-2小時，低溫(-2-0℃)離心，流速1-2kg/min/臺，收集沉淀，棄上清液；E)按1：15-25左右的稀釋比，用緩沖液2溶解收集的沉淀，攪拌1-2小時；F)用一只30SP深層濾芯串聯一只0.45μm的濾芯過濾懸浮液，用上述緩沖液2后洗濾芯，收集濾液；G)濾液降溫至-1℃，然后加入低溫乙醇(不高于-20℃)至乙醇濃度為8-10％(V/V)，低溫(-2-0℃)離心，流速1-2kg/min/臺，收集沉淀，棄上清液；H)按1：2-6的稀釋比，用緩沖液3溶解收集的沉淀，在20-30℃下攪拌0.5-2小時，用一只0.45μm的濾芯過濾懸浮液并用緩沖液3后洗濾芯，收集濾液；I)調節pH值至6.50-7.50，根據所需規格用上述緩沖液3將蛋白濃度稀釋至2.50-3.0％或5.5-6.0％；無菌分裝；J)凍干，采用預冷、速凍及多次“退火”操作，最后得到人纖維蛋白原凍干粉；K)沸水浴中干熱進行病毒滅活(100℃，30分鐘)。所述的組分I沉淀即經典的Cohn血漿組分I沉淀，其制備方法為：在去冷膠血漿中加入冷的50％乙醇溶液(溫度不高于-20℃)至乙醇濃度為8-10％(V/V)，調解血漿pH值至6.85-7.15，保持血漿溫度-2-2℃，均勻攪拌1-3小時后離心得到組分I沉淀。所述的步驟A中的緩沖液1的組成為：檸檬酸鈉·2H2O30-60mmol/L，TRIS10-30mmol/L，賴氨酸鹽酸10-30mmol/L，蔗糖1-3％(w/w)，甘氨酸0.5-5％(w/w)，氯化鈉0.1-0.15mol/L，pH值為6.50-7.50，溫度20-30℃。所述的步驟E中的緩沖液2的組成為：檸檬酸鈉·2H2O30-60mmol/L，TRIS10-30mmol/L，，精氨酸鹽酸鹽1-3％(w/w)，蔗糖1-3％(w/w)，甘氨酸0.5-5％(w/w)，氯化鈉0.1-0.15mol/L，pH值為6.50-7.50，溫度20-30℃。所述的步驟E的緩沖液2中還加入0.015-0.025％(w/w)的吐溫-80，促進了蛋白的快速分散與溶解。所述的步驟H中的緩沖液3的組成為：檸檬酸鈉·2H2O30-60mmol/L，精氨酸鹽酸鹽1-5％(w/w)，甘氨酸1-5％(w/w)，氯化鈉30-150mmol/L，pH值為6.50-7.50。所述的步驟C中在濾液中加入預先配好的S/D母液，使溶液中吐溫-80的濃度至1％(w/v)，TNBP的濃度至0.3％(w/v)，24-26℃下緩慢攪拌，保溫6小時。所述的步驟J中凍干的操作步驟為：采用預冷、速凍及多次“退火”操作，將預冷到3-5℃的制品迅速深冷至-50℃左右，保持1-2小時，然后迅速升溫至-30℃左右，保持0.5本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種速溶無析出的凍干人纖維蛋白原制備工藝，其特征在于，包括以下步驟：A)將組分I沉淀切碎，按1：10?20的稀釋比，投入緩沖液1中溶解，均勻攪拌1?2小時；所述的緩沖液1中甘氨酸的質量百分比為0.5?5％；B)用30SP深層濾芯串聯一只1.0μm的濾芯過濾懸浮液；用步驟A中所述的緩沖液1后洗濾芯，收集濾液；C)在濾液中加入S/D母液；D)將S/D溶液降溫至?1℃左右，用噴霧方式緩慢加入不高于?20℃的低溫乙醇至乙醇濃度為8?10％(V/V)；攪拌1?2小時，?2?0℃低溫離心，流速1?2kg/min/臺，收集沉淀，棄上清液；E)按1：15?25左右的稀釋比，用緩沖液2溶解收集的沉淀，攪拌1?2小時；F)用一只30SP深層濾芯串聯一只0.45μm的濾芯過濾懸浮液，用步驟E所述的緩沖液2后洗濾芯，收集濾液；G)濾液降溫至?1℃，然后加入不高于?20℃的低溫乙醇至乙醇濃度為8?10％(V/V)，?2?0℃低溫離心，流速1?2kg/min/臺，收集沉淀，棄上清液；H)按1：2?6的稀釋比，用緩沖液3溶解收集的沉淀，在20?30℃下攪拌0.5?2小時，用一只0.45μm的濾芯過濾懸浮液并用緩沖液3后洗濾芯，收集濾液；I)調節pH值至6.50?7.50，根據所需規格，用步驟H所述的緩沖液3將蛋白濃度稀釋至2.50?3.0％或5.5?6.0％；無菌分裝；J)凍干，采用預冷、速凍、退火及升華干燥與解析干燥，最后得到人纖維蛋白原凍干粉；K)沸水浴中干熱進行病毒滅活，溫度100℃，時間30分鐘。...

【技術特征摘要】
1.一種速溶無析出的凍干人纖維蛋白原制備工藝，其特征在于，包括以下步驟：A)將組分I沉淀切碎，按1：10-20的稀釋比，投入緩沖液1中溶解，均勻攪拌1-2小時；所述的緩沖液1中甘氨酸的質量百分比為0.5-5％；B)用30SP深層濾芯串聯一只1.0μm的濾芯過濾懸浮液；用步驟A中所述的緩沖液1后洗濾芯，收集濾液；C)在濾液中加入S/D母液；D)將S/D溶液降溫至-1℃左右，用噴霧方式緩慢加入不高于-20℃的低溫乙醇至乙醇濃度為8-10％(V/V)；攪拌1-2小時，-2-0℃低溫離心，流速1-2kg/min/臺，收集沉淀，棄上清液；E)按1：15-25左右的稀釋比，用緩沖液2溶解收集的沉淀，攪拌1-2小時；F)用一只30SP深層濾芯串聯一只0.45μm的濾芯過濾懸浮液，用步驟E所述的緩沖液2后洗濾芯，收集濾液；G)濾液降溫至-1℃，然后加入不高于-20℃的低溫乙醇至乙醇濃度為8-10％(V/V)，-2-0℃低溫離心，流速1-2kg/min/臺，收集沉淀，棄上清液；H)按1：2-6的稀釋比，用緩沖液3溶解收集的沉淀，在20-30℃下攪拌0.5-2小時，用一只0.45μm的濾芯過濾懸浮液并用緩沖液3后洗濾芯，收集濾液；I)調節pH值至6.50-7.50，根據所需規格，用步驟H所述的緩沖液3將蛋白濃度稀釋至2.50-3.0％或5.5-6.0％；無菌分裝；J)凍干，采用預冷、速凍、退火及升華干燥與解析干燥，最后得到人纖維蛋白原凍干粉；K)沸水浴中干熱進行病毒滅活，溫度100℃，時間30分鐘。2.根據權利要求1所述的速溶無析出的凍干人纖維蛋白原制備工藝，其特征在于，所述的步驟A的緩沖液1的組成為：檸檬酸鈉·2H2O30-60mmol/L，TRIS10-30mmol/L，賴氨酸鹽酸10-30mmol/L，蔗糖1-3％(w/w)，甘氨酸0.5-5％(...

【專利技術屬性】
技術研發人員：李春洲，
申請(專利權)人：上海洲躍生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：上海;31