促甲狀腺激素測定試劑盒及制作方法技術

本發明專利技術涉及醫學免疫學中熒光免疫層析技術領域，具體地說是一種促甲狀腺激素(TSH)測定試劑盒(熒光免疫層析法)及制作方法，設有試紙卡，其特征在于所述試紙卡由下至上依次設有：PVC板、樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，其中結合墊上吸附有稀土Eu

Thyroid stimulating hormone assay kit and method of making the same

The present invention relates to medical immunology fluorescence immunochromatographic technology field, in particular to a thyroid stimulating hormone (TSH) assay kit (fluorescence immunochromatographic assay) and a preparation method thereof, a test card, which is characterized in that the test card followed by the bottom is provided with a PVC board, with the sample pad, pad, nitrocellulose the membrane and absorbent pad, which combined pad adsorbed rare earth Eu

【技術實現步驟摘要】
促甲狀腺激素測定試劑盒及制作方法
：本專利技術涉及醫學免疫學中熒光免疫層析
，包括蛋白交聯技術、膜層析技術、標記免疫分析技術等。具體地說是一種能夠快速準確的對血清、血漿和全血等樣品中促甲狀腺激素進行定量分析的促甲狀腺激素測定試劑盒及制作方法。
技術介紹
：促甲狀腺激素(thyrotropin，thyroidstimulatinghormone，TSH)是腺垂體分泌的促進甲狀腺的生長和機能的激素。人類的TSH為一種糖蛋白，含211個氨基酸，糖類約占整個分子的15％。整個分子由兩條肽鏈——α鏈和β鏈組成。促甲狀腺激素(TSH)是調控甲狀腺細胞生長和甲狀腺激素合成及分泌的主要因子，由垂體促甲狀腺素細胞合成和分泌，并受甲狀腺激素的負反饋性調節。臨床上，TSH、FT3(FreeTriiodothyronine，即游離三碘甲狀腺原氨酸)和FT4(FreeThyroxine，即游離甲狀腺激素)聯合應用，用于甲狀腺功能紊亂的輔助診斷：(1)FT3、FT4升高伴TSH降低，多為甲狀腺本身的疾病引起的原發性甲亢。(2)FT3、FT4升高，TSH也升高，多為下丘腦—垂體功能紊亂引起的繼發性甲亢。(3)FT3、FT4降低伴TSH升高，多為原發于甲狀腺的機能減退。(4)FT3、FT4降低，TSH也降低，多為下丘腦—垂體功能受損引起的繼發性甲減。甲狀腺功能改變時，TSH的波動較甲狀腺激素更迅速而顯著，是反映下丘腦-垂體-甲狀腺軸功能的敏感指標。通過檢測血TSH水平可以反映甲狀腺功能狀態，有助于甲狀腺疾病的輔助篩查、輔助診斷、治療效果評判和預后判斷。免疫分析技術是利用微量抗原與相應的高特異性抗體之間的免疫反應，來檢測如激素、藥物、蛋白質、多肽、酶、腫瘤相關抗原、微生素、病毒、細菌及金屬元素等生物體內活性物質。免疫分析技術包括標記免疫分析、非標記免疫分析和儀器免疫分析。本試劑盒利用的含有稀土元素的羧基乳膠微球標記免疫分析技術是屬于標記免疫分析之一種。熒光免疫分析(FIA)和放射免疫分析(RIA)自問世以來，經歷了幾十年的發展，但是人們越來越感覺到FIA因自然本地太高，干擾檢測結果；RIA采用同位素標記，對人體有極大危害并給實驗帶來不便。酶免疫分析(EIA)也因酶本身不穩定，受其他影響因素較大，推廣應用受到限制。80年代初，人們開始研究用稀土元素代替熒光物質和同位素標記蛋白質或抗體，將時間分辨技術引入到生物檢測領域，建立了新型的超微量時間分辨熒光免疫分析技術(TimeresolvedFluoroimmunoassay，簡稱TrFIA)。該技術采用多學科先進技術，集結了其他免疫分析的特點，在免疫學、分子生物學、細胞學和醫學等領域，取得長足的發展和廣泛應用。TrFIA利用了具有獨特熒光特性的3價稀土離子及螯合物為示蹤物代替熒光物質、酶、同位素、化學發光物質，標記抗體、抗原、激素、多肽、蛋白質、核酸探針及生物細胞，待反應體系(如抗原抗體反應、核酸探針雜交、生物素親和素反應以及靶細胞對效應細胞的殺傷效應等)發生后，用TrFIA檢測儀測定反應產物中的熒光強度。根據產物熒光強度和相對熒光強度的比值，判斷反應體系中分析物的濃度，從而達到定量分析。在通常的熒光測定中，由于測試樣品中含有多種熒光成分，背景熒光(來自樣品中的膠體顆粒和溶劑分子引起的散射光以及血清中蛋白質和其他化合物發出的非特異性熒光)強度大、干擾強，成為熒光分析法大范圍推廣的瓶頸。TrFIA之所以能夠成為繼EIA、RIA之后一種新的靈敏的檢測方法，主要取決于鑭系元素獨特的熒光特點、檢測中采用的波長分辨和時間延遲技術以及解離-增強技術。鑭系元素(lanthanide,Ln)屬于稀土元素，共有17中，常用于TrFIA主要有銪(Eu)、釤(Sm)、鋱(Tb)、鏑(Dy)。鑭系元素具有獨特的熒光發光特點，與普通熒光相比，鑭系離子螯合物熒光衰變時間長，為傳統熒光的103-106倍。如鑭系離子螯合物的熒光衰變時間在60-900μs，常用的Eu3+熒光衰變時間為714μs，普通熒光免疫分析中熒光團的熒光衰變時間只有1-100μs，樣品中一些蛋白質的熒光衰變時間僅為1-10μs，因此利用時間分辨技術，延遲一定時間后測量，便可獲得Eu3+特異性熒光信號。同時由于衰變時間長，Eu3+標記物在測量時間里可以反復被激發，每次激發后由激發態很快躍遷到基態，就有熒光發出，然后又可被重新激發，如此每秒可有1000次激發，使得TrFIA熒光標記物的相對比活性很高。鑭系元素熒光光譜的最大特征是激發光與發射光之間的Stokes位移較大，Eu3+激發波長為337nm，發射波長為615nm，Stokes位移可達278nm；同時Eu3+被激發的熒光光帶極窄，熒光的發射峰非常尖銳，可使儀器調整在極窄的波長范圍內測定，這樣就幾乎完全消除了背景熒光的干擾，繼而通過時間延遲和波長分辨，將強特異性熒光和背景熒光辨開(故稱為時間分辨)，使干擾達到幾乎為零。鑒于以上標記方法及檢測技術的應用，本試劑盒具有良好的檢測特異性、較高的靈敏度、操作的簡便性以及穩定的熒光標記物保證了檢測的準確性。
技術實現思路
：本專利技術針對現有技術中存在的缺點和不足，提出了一種利用熒光免疫層析的靈敏性，結合熒光免疫層析分析儀實現的靈敏度高、快捷簡便，可以準確定量的促甲狀腺激素測定試劑盒及制作方法。本專利技術可以通過以下措施達到：一種促甲狀腺激素測定試劑盒，設有試紙卡，其特征在于所述試紙卡由下至上依次設有：PVC板、樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，其中結合墊上吸附有稀土Eu3+熒光微球標記的抗促甲狀腺激素單克隆抗體-微球偶聯復合物，所述稀土熒光微球的直徑為100-250nm，稀土熒光微球含稀土鑭系元素中的一種或幾種，在基態下穩定，在300-400nm的激發光源作用下發射出波長范圍為550-650nm的熒光；所述單克隆抗體為純化后混合的單克隆抗體，來源于針對2-6個不同的促甲狀腺激素抗原表位的單克隆抗體細胞株。本專利技術所述結合墊的稀土熒光微球的直徑是120-200nm；所述稀土熒光微球含有一種或幾種稀土鑭系元素；結合墊上稀土熒光微球標記的抗體優選來源于針對2個不同抗原表位的單克隆細胞細胞株。本專利技術所述結合墊采用如下步驟制得：將玻璃纖維膜浸泡于150mMTris-HCL處理液中(含1.0％TritonX-100，2.5％BSA，pH7.4)，4℃浸泡2小時，然后取出37℃烘箱烘干4小時，備用，將玻璃纖維膜放在Bio-DotXYZ3050三維噴點平臺上，用Bio-JetQuanti300非接觸式微定量噴頭將稀土熒光微球標記的抗促甲狀腺激素單克隆抗體偶聯復合物噴到玻璃纖維膜，37℃烘干1小時后制得。本專利技術中結合墊上的所述稀土熒光微球標記的抗促甲狀腺激素單克隆抗體采用如下步驟制得：步驟1：單克隆抗體細胞株的獲得：用促甲狀腺激素純品免疫小鼠，采用標準的單克隆抗體制備方法制備特異性高親和力的單克隆抗體細胞株，對所獲得的單抗細胞株進行配對篩選，根據配對結果和親和力數據優選出用于試劑盒的單抗細胞株；步驟2：單克隆抗體的制備：采用標準的腹水生產工藝制備并純化抗促甲狀腺激素單克隆抗體，分裝后保存于-20℃備用；步驟3：稀土熒光微球的醛基化：取5mg稀土熒光微球，用20mM，pH9.本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種促甲狀腺激素測定試劑盒，設有試紙卡，其特征在于所述試紙卡由下至上依次設有：PVC板、樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，其中結合墊上吸附有稀土Eu

【技術特征摘要】
1.一種促甲狀腺激素測定試劑盒，設有試紙卡，其特征在于所述試紙卡由下至上依次設有：PVC板、樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，其中結合墊上吸附有稀土Eu3+熒光微球標記的抗促甲狀腺激素單克隆抗體-微球偶聯復合物，所述稀土熒光微球的直徑為100-250nm，稀土熒光微球含稀土鑭系元素中的一種或幾種，在基態下穩定，在300-400nm的激發光源作用下發射出波長范圍為550-650nm的熒光；所述單克隆抗體為純化后混合的單克隆抗體，來源于針對2-6個不同的促甲狀腺激素抗原表位的單克隆抗體細胞株。2.根據權利要求1所述的一種促甲狀腺激素測定試劑盒，其特征在于所述結合墊的稀土熒光微球的直徑是120-200nm；結合墊上稀土熒光微球標記的抗體來源于針對2個不同抗原表位的單克隆細胞細胞株；結合墊上吸附有稀土Eu3+熒光微球標記的抗促甲狀腺激素單克隆抗體-微球偶聯復合物。3.根據權利要求1所述的一種促甲狀腺激素測定試劑盒，其特征在于稀土熒光微球的直徑為150nm，稀土熒光微球含稀土鑭系元素Eu3+，在基態下穩定，在337nm的激發光源作用下發射出波長615nm的熒光。4.根據權利要求1所述的一種促甲狀腺激素測定試劑盒，其特征在于所述結合墊的稀土熒光微球的直徑是200nm；所述稀土熒光微球摻雜有稀土鑭系元素Eu3+。5.根據權利要求1所述的一種促甲狀腺激素測定試劑盒，其特征在于所述結合墊采用如下步驟制得：將玻璃纖維膜浸泡于150mMTris-HCL處理液中，Tris-HCL處理液含1.0％TritonX-100，2.5％BSA，pH7.4，4℃浸泡2小時，然后取出37℃烘箱烘干4小時，備用，將玻璃纖維膜放在Bio-DotXYZ3050三維噴點平臺上，用Bio-JetQuanti300非接觸式微定量噴頭將稀土Eu3+熒光微球標記的抗促甲狀腺激素單克隆抗體偶聯復合物噴到玻璃纖維膜，37℃烘干1小時后制得。6.根據權利要求1所述的一種促甲狀腺激素測定試劑盒，其特征在于結合墊上的所述稀土熒光微球標記的促甲狀腺激素單克隆抗體采用如下步驟制得：步驟1：單克隆抗體細胞株的獲得：用促甲狀腺激素純品免疫小鼠，采用標準的單克隆抗體制備方法制備特異性高親和力的單克隆抗體細胞株，對所獲...

【專利技術屬性】
技術研發人員：王鵬浩，宋璐琳，王文亮，劉衍亮，陳萍萍，孫寧寧，
申請(專利權)人：威海紐普生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：山東,37