用于生物合成化合物的方法、試劑和細胞技術

本文件描述了使用脂肪酸O?甲基轉移酶，醇O?乙酰轉移酶，和單加氧酶的一種或多種產生7?羥基庚酸甲酯和庚酸庚酯的生化途徑，以及表達此類外源酶的一種或多種的重組宿主。可將7?羥基庚酸甲酯和庚酸庚酯酶促轉化為庚二酸，7?氨基庚酸，7?羥基庚酸，七亞甲基二胺，或1,7?庚二醇。

Methods, reagents, and cells for biosynthesis of compounds

This document describes the use of O fatty acid methyltransferase, O alcohol acetyltransferase, biochemical pathways to produce 7 hydroxy methyl heptylate and heptyl heptylate and one or more monooxygenase, and one or more expression of the exogenous enzyme recombinant host. The 7 hydroxy methyl heptylate and heptanoic acid enzymatic g into Pimelic acid, 7 amino heptanoic acid, 7 hydroxy heptanoic acid, seven methylene amine two, or 1,7 heptanal.

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】用于生物合成化合物的方法、試劑和細胞對相關申請的交叉引用本申請要求2014年06月16日提交的美國臨時申請系列號62/012,659，2014年06月16日提交的美國臨時申請系列號62/012,666，和2014年06月16日提交的美國臨時申請系列號62/012,604的權益，其公開內容通過提述以其整體并入本文。專利
本專利技術涉及使用一種或多種分離的酶，諸如脂肪酸O-甲基轉移酶，醇O-乙酰轉移酶和單加氧酶來生物合成7-羥基庚酸甲酯和庚酸庚酯的方法，以及涉及表達一種或多種此類酶的重組宿主細胞。本專利技術還涉及使用一種或多種酶，諸如單加氧酶，脫甲基酶，或酯酶，將7-羥基庚酸甲酯和庚酸庚酯酶促轉化為7-羥基庚酸和1,7-庚二醇的方法，以及表達一種或多種此類酶的重組宿主細胞。另外，本專利技術涉及將7-羥基庚酸和/或1,7-庚二醇酶促轉化為庚二酸，7-氨基庚酸，七亞甲基二胺或1,7-庚二醇(下文稱為“C7構件塊”)的方法，以及產生此類C7構件塊的重組宿主。專利技術背景尼龍是聚酰胺，其一般通過二胺與二羧酸的縮合聚合(condensationpolymerization)合成。類似地，可以通過內酰胺的縮合聚合生成尼龍。一種普遍存在的尼龍是尼龍6,6，其通過六亞甲基二胺(HMD)和己二酸的縮合聚合生成。可以通過己內酰胺的開環聚合生成尼龍6(Anton&Baird,PolyamidesFibers,EncyclopediaofPolymerScienceandTechnology,2001)。尼龍7和尼龍7,7代表新型聚酰胺，其與尼龍6和尼龍6,6相比具有增值特性。尼龍7通過7-氨基庚酸的聚合制備，而尼龍7,7通過庚二酸和七亞甲基二胺的縮合聚合制備。不存在經濟上可行的石油化學途徑以產生尼龍7和尼龍7,7的單體。鑒于沒有經濟上可行的石油化學單體原料，生物技術通過生物催化提供了一種替代方法。生物催化是使用生物催化劑(如酶)來進行有機化合物的生化轉化。生物衍生的原料和石油化學原料兩者都是用于生物催化過程的可行的起始材料。因此，針對這種背景，顯然需要產生庚二酸，7-羥基庚酸，7-氨基庚酸，七亞甲基二胺和1,7-庚二醇(下文稱為“C7構件塊”)中一種或多種的方法，其中所述方法是基于生物催化劑的。然而，沒有野生型原核生物或真核生物天然地過量產生或分泌此類C7構件塊到細胞外環境。盡管如此，已報道庚二酸的代謝。二羧酸庚二酸作為碳源通過許多細菌和酵母，經由β-氧化有效地轉化為中心代謝物。輔酶A(CoA)活化的庚二酸到CoA活化的3-氧代庚二酸的β-氧化促進了進一步分解代謝，其通過例如與芳族底物降解相關的途徑實現。已經全面地表征了通過幾種細菌將3-氧代庚二酰-CoA分解代謝成乙酰-CoA和琥珀酰-CoA(HarwoodandParales,AnnualReviewofMicrobiology,1996,50,553-590)。最優性原理敘述，微生物調節它們的生化網絡來支持最大生物質(biomass)生長。超出在宿主生物體中表達異源途徑的需要，將碳通量引導到充當碳源而非生物質生長組分的C7構件塊與最優性原理矛盾。例如，將1-丁醇途徑從梭菌屬(Clostridium)物種轉移至其它生產菌株與天然生產者的生產性能相比經常相差一個數量級(Shen等人,Appl.Environ.Microbiol.,2011,77(9):2905–2915)。七碳脂肪族主鏈前體的有效合成是在C7脂肪族主鏈上形成末端官能團，如羧基，胺或羥基基團前合成一個或多個C7構件塊的關鍵考慮。專利技術概述本文至少部分基于這樣的發現，即可以構建產生七碳鏈脂肪族主鏈前體的生化途徑，其中可以形成一個或兩個官能團(即羧酸，胺或羥基)，導致合成庚二酸，7-氨基庚酸，7-羥基庚酸，七亞甲基二胺和1,7-庚二醇(以下稱為“C7構件塊”)的一種或多種。庚二酸和庚二酸鹽/酯，7-羥基庚酸和7-羥基庚酸鹽/酯，以及7-氨基庚酸和7-氨基庚酸鹽/酯在本文中可互換使用，指任何其中性或離子化形式的化合物，包括其任何鹽形式。本領域技術人員應當理解，具體形式將取決于pH。本領域技術人員理解，當存在于親本化合物中的酸性質子被金屬離子，例如堿金屬離子，堿土金屬離子或鋁離子替代；或與有機堿配位時，含有羧酸基團的化合物(包括但不限于有機一元酸，羥基酸，氨基酸和二羧酸)得以形成或被轉化成其離子鹽形式。可接受的有機堿包括但不限于乙醇胺，二乙醇胺，三乙醇胺，氨丁三醇，N-甲基葡糖胺等。可接受的無機堿包括但不限于氫氧化鋁，氫氧化鈣，氫氧化鉀，碳酸鈉，氫氧化鈉等。將本專利技術的鹽分離為鹽或通過經由添加酸或用酸性離子交換樹脂處理將pH降至pKa以下而轉化成游離酸。本領域技術人員理解，含有胺基團的化合物(包括但不限于有機胺，氨基酸和二胺)得以形成或被轉化為它們的離子鹽形式，例如通過向胺中加入酸性質子形成銨鹽，與無機酸如鹽酸，氫溴酸，硫酸，硝酸，磷酸等形成；或與有機酸形成，包括但不限于乙酸，丙酸，己酸，環戊烷丙酸，乙醇酸，丙酮酸，乳酸，丙二酸，琥珀酸，蘋果酸，馬來酸，富馬酸，酒石酸，檸檬酸，苯甲酸，3-(4-羥基苯甲酰基)苯甲酸，肉桂酸，扁桃酸，甲磺酸，乙磺酸，1,2-乙二磺酸，2-羥基乙磺酸，苯磺酸，2-萘磺酸，4-甲基雙環-[2.2.2]辛-2-烯-1-羧酸，葡庚糖酸，4,4'-亞甲基雙-(3-羥基-2-烯-1-羧酸)，3-苯基丙酸，三甲基乙酸，叔丁基乙酸，月桂基硫酸，葡糖酸，谷氨酸，羥基萘甲酸，水楊酸，硬脂酸，粘康酸等。可接受的無機堿包括但不限于氫氧化鋁，氫氧化鈣，氫氧化鉀，碳酸鈉，氫氧化鈉等。本專利技術的鹽以鹽的形式分離或通過經由添加堿或用堿性離子交換樹脂處理將pH至高于pKb轉化成游離胺。本領域技術人員理解，含有胺基團和羧酸基團兩者的化合物(包括但不限于氨基酸)通過以下形成或轉化成它們的離子鹽形式：通過1)與無機酸形成的酸加成鹽，所述無機酸包括但不限于鹽酸，氫溴酸，硫酸，硝酸，磷酸等；或與有機酸形成的酸加成鹽，所述有機酸包括但不限于乙酸，丙酸，己酸，環戊烷丙酸，乙醇酸，丙酮酸，乳酸，丙二酸，琥珀酸，蘋果酸，馬來酸，富馬酸，酒石酸，檸檬酸，苯甲酸，3-(4-羥基苯甲酰基)苯甲酸，肉桂酸，扁桃酸，甲磺酸，乙磺酸，1,2-乙二磺酸，2-羥基乙磺酸，苯磺酸，2-萘磺酸，4-甲基雙環-[2.2.2]辛-2-烯-1-羧酸，葡庚糖酸，4,4'-亞甲基雙-(3-羥基-2-烯-1-羧酸)，3-苯基丙酸，三甲基乙酸酸，叔丁基乙酸，月桂基硫酸，葡糖酸，谷氨酸，羥基萘甲酸，水楊酸，硬脂酸，粘康酸等。可接受的無機堿包括但不限于氫氧化鋁，氫氧化鈣，氫氧化鉀，碳酸鈉，氫氧化鈉等，或2)當存在于親本化合物中的酸性質子被金屬離子，例如堿金屬離子，堿土金屬離子或鋁離子置換時；或與有機堿配位。可接受的有機堿包括但不限于乙醇胺，二乙醇胺，三乙醇胺，氨丁三醇，N-甲基葡糖胺等。可接受的無機堿包括但不限于氫氧化鋁，氫氧化鈣，氫氧化鉀，碳酸鈉，氫氧化鈉等。本專利技術的鹽可以作為鹽分離或通過經由添加酸或用酸性離子交換樹脂處理將pH降至pKa以下而轉化為游離酸。本文所述的途徑，代謝工程和培養策略可以依賴于例如使用脂肪酸O-甲基轉移酶從庚酸產生庚酸甲酯，和例如使用單加氧酶從庚本文檔來自技高網...

【技術保護點】
在重組宿主中產生末端羥基(C

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2014.06.16 US 62/012,659;2014.06.16 US 62/012,604;1.在重組宿主中產生末端羥基(C3-8羥基烷基)-C(＝O)OCH3酯的方法，所述方法包括：a)將C4-9羧酸酶促轉化為(C3-8烷基)-C(＝O)OCH3酯；并且b)將(C3-8烷基)-C(＝O)OCH3酯酶促轉化為末端羥基(C3-8羥基烷基)-C(＝O)OCH3酯。2.權利要求1的方法，其中使用具有脂肪酸O-甲基轉移酶活性的多肽將所述C4-9羧酸酶促轉化為所述(C3-8烷基)-C(＝O)OCH3酯。3.權利要求2的方法，其中所述具有脂肪酸O-甲基轉移酶活性的多肽與SEQIDNO:23，SEQIDNO:24，或SEQIDNO:25所列的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。4.權利要求1-3中任一項的方法，其中使用具有單加氧酶活性的多肽將所述(C3-8烷基)-C(＝O)OCH3酯酶促轉化為所述末端羥基(C3-8羥基烷基)-C(＝O)OCH3酯。5.權利要求4的方法，其中所述單加氧酶被歸類于EC1.14.14.-或EC1.14.15.-下。6.權利要求4的方法，其中所述單加氧酶與SEQIDNO:14，SEQIDNO:15，SEQIDNO:16，SEQIDNO:28,和/或SEQIDNO:29所列的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。7.權利要求1-6任一項的方法，其中從C4-9烷酰基CoA酶促產生所述C4-9羧酸。8.權利要求7的方法，其中所述具有硫酯酶活性的多肽從所述C4-9烷酰基CoA酶促產生所述C4-9羧酸。9.權利要求8的方法，其中所述硫酯酶與SEQIDNO:1，SEQIDNO:33,或SEQIDNO:34所列的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。10.權利要求7的方法，其中具有丁醛脫氫酶活性的多肽和具有醛脫氫酶活性的多肽從所述C4-9烷酰基CoA酶促產生所述C4-9羧酸。11.權利要求1-10中任一項的方法，所述方法還包括將所述末端羥基(C3-8羥基烷基)-C(＝O)OCH3酯酶促轉化為末端羥基C4-9羥基鏈烷酸(hydroxyalkanoate)。12.權利要求11的方法，其中具有脫甲基酶活性的多肽或具有酯酶活性的多肽將所述末端羥基(C3-8羥基烷基)-C(＝O)OCH3酯酶促轉化為末端羥基C4-9羥基鏈烷酸。13.權利要求1-12中任一項的方法，其中所述C4-9羧酸是庚酸，并且被酶促轉化成庚酸甲酯；并且將所述庚酸甲酯酶促轉化成7-羥基庚酸甲酯。14.權利要求7-13中任一項的方法，其中所述C4-9烷酰基CoA是庚酰基CoA，且從庚酰基CoA酶促產生庚酸。15.在重組宿主中產生一種或多種末端羥基取代的(C4-9烷基)-OC(＝O)-(C3-8烷基)酯的方法，所述方法包括：a)在所述宿主中將C4-9烷酰基CoA酶促轉化為(C4-9烷基)-OC(＝O)-(C3-8烷基)酯；并且b)在所述宿主中將所述(C4-9烷基)-OC(＝O)-(C3-8烷基)酯酶促轉化為(C4-9烷基)-OC(＝O)-(C3-8羥基烷基)酯，(C4-9羥基烷基)-OC(＝O)-(C3-8羥基烷基)酯，或(C4-9羥基烷基)-OC(＝O)-(C3-8烷基)酯的任一種。16.權利要求15的方法，其中使用具有醇O-乙酰轉移酶活性的多肽將C4-9烷酰基CoA酶促轉化為所述(C4-9烷基)-OC(＝O)-(C3-8烷基)酯。17.權利要求16的方法，其中所述具有醇O-乙酰轉移酶活性的多肽與SEQIDNO:26所列的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。18.權利要求15-17中任一項的方法，其中使用具有單加氧酶活性的多肽將(C4-9烷基)-OC(＝O)-(C3-8烷基)酯酶促轉化為(C4-9烷基)-OC(＝O)-(C3-8羥基烷基)酯，(C4-9羥基烷基)-OC(＝O)-(C3-8羥基烷基)酯，或(C4-9羥基烷基)-OC(＝O)-(C3-8烷基)酯的任一種。19.權利要求18的方法，其中所述具有單加氧酶活性的多肽被歸類于EC1.14.14.-或EC1.14.15.-下。20.權利要求18或權利要求19的方法，其中所述單加氧酶與SEQIDNO:14，SEQIDNO:15，SEQIDNO:16，SEQIDNO:28,和/或SEQIDNO:29所列的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。21.權利要求15-20中任一項的方法，所述方法還包括將(C4-9羥基烷基)-OC(＝O)-(C3-8羥基烷基)酯或(C4-9羥基烷基)-OC(＝O)-(C3-8烷基)酯酶促轉化為末端羥基C4-9羥基鏈烷酸。22.權利要求21的方法，其中所述具有酯酶活性的多肽將(C4-9羥基烷基)-OC(＝O)-(C3-8羥基烷基)酯或(C4-9羥基烷基)-OC(＝O)-(C3-8烷基)酯酶促轉化為所述C4-9羥基鏈烷酸。23.權利要求15-22中任一項的方法，其中所述C4-9烷酰基CoA是庚酰基CoA，并且酶促轉化為庚酸庚酯；并且使用具有單加氧酶活性的多肽將庚酸庚酯酶促轉化為7-羥基庚酸庚酯，7-羥基庚酸7-羥基庚酯，或庚酸7-羥基庚酯中的任一種。24.權利要求23的方法，所述方法還包含將7-羥基庚酸7-羥基庚酯或7-羥基庚酸庚酯酶促轉化為7-羥基庚酸。25.權利要求24的方法，其中具有酯酶活性的多肽將7-羥基庚酸7-羥基庚酯或7-羥基庚酸庚酯酶促轉化為7-羥基庚酸。26.權利要求23-25中任一項的方法，所述方法還包括將7-羥基庚酸7-羥基庚酯或庚酸7-羥基庚酯酶促轉化為1,7-庚二醇。27.權利要求26的方法，其中具有酯酶活性的多肽將7-羥基庚酸7-羥基庚酯或庚酸7-羥基庚酯酶促轉化為1,7-庚二醇。28.權利要求26或權利要求27的方法，還包括將1,7-庚二醇酶促轉化為7-羥基庚酸。29.權利要求28的方法，其中具有醇脫氫酶活性的多肽和具有醛脫氫酶活性的多肽將1,7-庚二醇酶促轉化為7-羥基庚酸。30.權利要求13-14中任一項的方法，所述方法還包括將7-羥基庚酸甲酯酶促轉化為7-羥基庚酸。31.權利要求30的方法，其中具有脫甲基化酶的多肽或具有酯酶活性的多肽將7-羥基庚酸甲酯酶促轉化為7-羥基庚酸。32.權利要求24-31的方法，所述方法還包括將7-羥基庚酸酶促轉化為選自由以下組成的組的產物：庚二酸，庚二酸半醛，7-氨基庚酸，七亞甲基二胺和1,7-庚二醇。33.權利要求32的方法，其中所述方法包括使用具有醇脫氫酶活性的多肽，具有6-羥基己酸脫氫酶活性的多肽，具有5-羥基戊酸脫氫酶活性的多肽，具有4-羥基丁酸脫氫酶活性的多肽，或具有單加氧酶活性的多肽，將7-羥基庚酸酶促轉化為庚二酸半醛。34.權利要求33的方法，所述方法還包括使用具有5-氧代戊酸脫氫酶活性的多肽，具有6-氧代己酸脫氫酶活性的多肽，具有7-氧代庚酸脫氫酶活性的多肽，具有醛脫氫酶活性的多肽，或具有單加氧酶活性的多肽，將庚二酸半醛酶促轉化為庚二酸。35.權利要求33的方法，所述方法還包括將庚二酸半醛酶促轉化為7-氨基庚酸。36.權利要求35的方法，其中具有ω-轉氨酶活性的多肽將庚二酸半醛酶促轉化為7-氨基庚酸。37.權利要求35或權利要求36的方法，還包括將7-氨基庚酸酶促轉化為七亞甲基二胺。38.權利要求33的方法，所述方法還包括將庚二酸半醛酶促轉化成七亞甲基二胺。39.權利要求37或權利要求38的方法，其中使用具有羧酸還原酶活性的多肽和/或具有ω-轉氨酶活性的多肽，以及任選地具有N-乙酰轉移酶活性的多肽，具有乙酰基腐胺脫乙酰酶活性的多肽和具有醇脫氫酶活性的多肽中的一種或多種將庚二酸半醛或7-氨基庚酸酶促轉化成七亞甲基二胺。40.權利要求39的方法，其中由sfp的基因產物增強所述具有羧酸還原酶的多肽。41.權利要求39或權利要求40的方法，其中使用具有羧酸還原酶活性的多肽和具有醇脫氫酶活性的多肽將7-羥基庚酸酶促轉化為1,7-庚二醇。42.權利要求41的方法，還包括將1,7-庚二醇酶促轉化為七亞甲基二胺。43.權利要求42的方法，其中具有醇脫氫酶活性的多肽和具有ω-轉氨酶活性的多肽將1,7-庚二醇酶促轉化為七亞甲基二胺。44.權利要求32的方法，其中具有羧酸還原酶活性的多肽，具有ω-轉氨酶活性的多肽和具有醇脫氫酶活性的多肽將7-羥基庚酸酶促轉化為七亞甲基二胺。45.權利要求36，39-40和43-44中任一項的方法，其中所述具有ω-轉氨酶活性的多肽與SEQIDNO:8-13所列的氨基酸序列的任一種具有至少70％的序列同一性。46.權利要求14和23-45中任一項的方法，其中通過CoA依賴性碳鏈延長的兩個循環從乙酰CoA和丙酰CoA產生庚酰CoA。47.權利要求46的方法，其中所述CoA依賴性碳鏈延長的兩個循環的每個包括使用(i)具有β-酮硫解酶活性的多肽或具有乙酰CoA羧化酶活性的多肽和具有β-酮酰基-[acp]合酶活性的多肽，(ii)具有3-羥基酰基CoA脫氫酶活性的多肽或具有3-氧代酰基CoA還原酶活性的多肽，(iv)具有烯酰基CoA水合酶活性的多肽，和(v)具有反式-2-烯酰CoA還原酶活性的多肽從乙酰基CoA和丙酰CoA形成庚酰基CoA。48.酶促產生7-羥基庚酸的方法，所述方法包括：a)使用具有脂肪酸O-甲基轉移酶活性的多肽將庚酸酶促轉化為庚酸甲酯；b)使用具有單加氧酶活性的多肽將庚酸甲酯酶促轉化為7-羥基庚酸甲酯；并且c)使用具有脫甲基酶活性的多肽或具有酯酶活性的多肽將7-羥基庚酸甲酯酶促轉化為7-羥基庚酸。49.酶促產生7-羥基庚酸的方法，所述方法包括：a)使用具有醇O-乙酰轉移酶活性的多肽將庚酰CoA酶促轉化為庚酸庚酯；b)使用具有單加氧酶活性的多肽將庚酸庚酯酶促轉化為7-羥基庚酸庚酯，庚酸7-羥基庚酯或7-羥基庚酸7-羥基庚酯；并且c)使用具有酯酶活性的多肽將7-羥基庚酸庚酯，庚酸7-羥基庚酯或7-羥基庚酸7-羥基庚酯酶促轉化為7-羥基庚酸。50.權利要求1-49的方法，其中所述宿主經受需氧、厭氧或微需氧培養條件下的培養策略。51.權利要求50的方法，其中在營養限制條件，如磷酸鹽，氮和氧限制條件下培養所述重組宿主。52.根據權利要求50或權利要求51的方法，其中使用陶瓷膜保留所述重組宿主細胞以在發酵期間維持高細胞密度。53.權利要求50-52中任一項的方法，其中補料到所述重組宿主的主要碳源源自生物給料。54.權利要求53的方法，其中所述生物給料是或源自單糖，二糖，木質纖維素，半纖維素，纖維素，木質素，乙酰丙酸，甲酸，甘油三酯，甘油，脂肪酸，農業廢物，濃縮的酒糟可溶物(condenseddistillers'solubles)或城市廢物。55.權利要求50-52中任一項的方法，其中補料到所述重組宿主的主要碳源源自非生物給料。56.權利要求55的方法，其中所述非生物給料是或源自天然氣，合成氣(syngas)，CO2/H2，甲醇，乙醇，苯甲酸鹽/酯，來自環己烷氧化過程的非揮發性殘留物(NVR)堿洗液廢物流，或對苯二甲酸/間苯二甲酸混合物廢物流。57.權利要求50-56中任一項的方法，其中所述宿主是原核生物。58.權利要求57的方法，其中所述原核生物來自選自下組的屬：埃希氏菌屬(Escherichia)；梭菌屬(Clostridia)；棒狀桿菌屬(Corynebacteria)；貪銅菌屬(Cupriavidus)；假單胞菌屬(Pseudomonas)；代爾夫特菌屬(Delftia)；芽孢桿菌屬(Bacillus)；乳桿菌屬(Lactobacillus)；乳球菌屬(Lactococcus)和紅球菌屬(Rh...

【專利技術屬性】
技術研發人員：AL博特斯，AVE康拉迪，R哈杜什，
申請(專利權)人：英威達技術有限責任公司，
類型：發明
國別省市：瑞士,CH