用于生物合成化合物的方法，試劑和細胞技術

本文件描述了使用脂肪酸O?甲基轉移酶，醇O?乙酰轉移酶和單加氧酶中的一種或多種產(chǎn)生6?羥基己酸甲酯和己酸己酯的生物化學途徑，以及表達一種或多種此類酶的重組宿主。可以將6?羥基己酸甲酯和己酸己酯酶促轉化為己二酸，己二酸半醛，6?氨基己酸，6?羥基己酸，六亞甲基二胺和1,6?己二醇。

Methods, reagents, and cells for biosynthesis of compounds

This document describes the use of O fatty acid methyl transferase enzyme, and one or more enzymes in single 6 hydroxy methyl hexanoate and Hexyl Hexanoate the biochemical pathway of transfer acetyl alcohol O, as well as the expression of one or more of these enzymes in recombinant host. Can be 6 hydroxy methyl hexanoate Hexyl Hexanoate and enzymatic conversion of adipic acid, adipaldehyde, 6 aminocaproic acid, 6 3-hydroxyhexanoate six, two methylene amine and 1,6 hexandiol.

【技術實現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術】用于生物合成化合物的方法，試劑和細胞對相關申請的交叉引用本申請要求于2014年6月16日提交的美國臨時申請序列號62/012,659，于2014年6月16日提交的62/012,666和于2014年6月16日提交的62/012,604的權益，其全部內(nèi)容通過引用并入本文。
本專利技術涉及使用一種或多種分離的酶(如脂肪酸O-甲基轉移酶，醇O-乙酰轉移酶和單加氧酶)生物合成6-羥基己酸甲酯和己酸己酯的方法，以及表達一種或多種此類酶的重組宿主細胞。本專利技術還涉及使用一種或多種酶，如酯酶，單加氧酶和脫甲基酶將6-羥基己酸甲酯和己酸己酯酶促轉化為6-羥基己酸和1,6-己二醇的方法。此外，本專利技術涉及將6-羥基己酸和/或1,6-己二醇酶促轉化為己二酸，6-氨基己酸，六亞甲基二胺或1,6-己二醇(以下稱為“C6構件塊”)和產(chǎn)生此類C6構件塊的重組宿主。專利技術背景尼龍是聚酰胺，其一般通過二胺與二羧酸的縮合聚合(condensationpolymerization)合成。類似地，可以通過內(nèi)酰胺的縮合聚合生成尼龍。一種普遍存在的尼龍是尼龍6,6，其通過六亞甲基二胺(HMD)和己二酸的縮合聚合生成。可以通過己內(nèi)酰胺的開環(huán)聚合生成尼龍6(Anton&Baird,PolyamidesFibers,EncyclopediaofPolymerScienceandTechnology,2001)。生物技術通過生物催化提供了石油化學方法的備選方法。生物催化是使用生物催化劑，如酶，來進行有機化合物的生物化學轉化。生物衍生的原料和石油化學原料兩者都是用于生物催化過程的可行的起始材料。因而，針對此背景，清楚的是需要用于生產(chǎn)己二酸,6-羥基己酸,6-氨基己酸,六亞甲基二胺和1,6-己二醇(下文稱為“C6構件塊”)中的一種或多種的可持續(xù)的方法，其中所述方法是基于生物催化的。然而，無野生型原核生物或真核生物天然過度生成或分泌C6構件塊到細胞外環(huán)境。但是，己二酸的代謝已有報道。許多細菌和酵母經(jīng)由β-氧化將二羧酸己二酸作為碳源高效轉化為中心代謝產(chǎn)物。輔酶A(CoA)活化的己二酸至CoA活化的3-氧代己二酸的β-氧化通過例如與芳族底物降解相關的途徑促進進一步的分解代謝。已經(jīng)全面地表征通過幾種細菌將3-氧代己二酰基-CoA分解代謝成乙酰基-CoA和琥珀酰基-CoA。最優(yōu)性原理敘述，微生物調(diào)節(jié)它們的生物化學網(wǎng)絡來支持最大生物質(biomass)生長。超出在宿主生物體中表達異源途徑的需要，將碳通量引導到充當碳源的C6構件塊而非生物質生長組分與最優(yōu)性原理矛盾。例如，將1-丁醇途徑從梭菌屬(Clostridium)物種轉移至其它生產(chǎn)菌株與天然生產(chǎn)者的生產(chǎn)性能相比經(jīng)常相差一個數(shù)量級(Shen等人,Appl.Environ.Microbiol.,2011,77(9):2905–2915)。七碳脂肪族主鏈前體的有效合成是在C6脂肪族主鏈上形成末端官能團，如羧基，胺或羥基基團前合成一個或多個C6構件塊的關鍵考慮。專利技術概述本文件至少部分地基于以下發(fā)現(xiàn)：可以構建用于產(chǎn)生七碳鏈脂肪族主鏈前體的生物化學途徑，其中可以形成一個或兩個官能團，即羧基，胺或羥基，從而導致己二酸，6-氨基己酸，6-羥基己酸，六亞甲基二胺和1,6-己二醇(下文稱為“C6構件塊”)中的一種或多種的合成。己二酸和己二酸鹽(酯)，6-羥基己酸和6-羥基己酸鹽(酯)，以及6-氨基己酸和6-氨基己酸鹽(酯)在本文中可互換使用，是指任何其中性或離子化形式的相關化合物，包括其任何鹽形式。本領域技術人員應當理解，具體形式將取決于pH。本領域技術人員理解，當存在于親本化合物中的酸性質子被金屬離子，例如堿金屬離子，堿土金屬離子或鋁離子替代；或與有機堿配位時，含有羧酸基團的化合物(包括但不限于有機一元酸，羥基酸，氨基酸和二羧酸)形成或轉化成其離子鹽形式。可接受的有機堿包括但不限于乙醇胺，二乙醇胺，三乙醇胺，氨丁三醇，N-甲基葡糖胺等。可接受的無機堿包括但不限于氫氧化鋁，氫氧化鈣，氫氧化鉀，碳酸鈉，氫氧化鈉等。將本專利技術的鹽分離為鹽或通過經(jīng)由添加酸或用酸性離子交換樹脂處理將pH降至pKa以下而轉化成游離酸。本領域技術人員理解，含有胺基團的化合物(包括但不限于有機胺，氨基酸和二胺)形成或轉化為它們的離子鹽形式，例如通過向胺中加入酸性質子形成銨鹽，與無機酸如鹽酸，氫溴酸，硫酸，硝酸，磷酸等形成；或與有機酸形成，包括但不限于乙酸，丙酸，己酸，環(huán)戊烷丙酸，乙醇酸，丙酮酸，乳酸，丙二酸，琥珀酸，蘋果酸，馬來酸，富馬酸，酒石酸，檸檬酸，苯甲酸，3-(4-羥基苯甲酰基)苯甲酸，肉桂酸，扁桃酸，甲磺酸，乙磺酸，1,2-乙二磺酸，2-羥基乙磺酸，苯磺酸，2-萘磺酸，4-甲基雙環(huán)-[2.2.2]辛-2-烯-1-羧酸，葡庚糖酸，4,4'-亞甲基雙-(3-羥基-2-烯-1-羧酸)，3-苯基丙酸，三甲基乙酸，叔丁基乙酸，月桂基硫酸，葡糖酸，谷氨酸，羥基萘甲酸，水楊酸，硬脂酸，粘康酸等。可接受的無機堿包括但不限于氫氧化鋁，氫氧化鈣，氫氧化鉀，碳酸鈉，氫氧化鈉等。本專利技術的鹽以鹽的形式分離或通過經(jīng)由添加堿或用堿性離子交換樹脂處理將pH至高于pKb轉化成游離胺。本領域技術人員理解，含有胺基團和羧酸基團兩者的化合物(包括但不限于氨基酸)通過以下形成或轉化成它們的離子鹽形式：通過1)與無機酸形成的酸加成鹽，所述無機酸包括但不限于鹽酸，氫溴酸，硫酸，硝酸，磷酸等；或與有機酸形成的酸加成鹽，所述有機酸包括但不限于乙酸，丙酸，己酸，環(huán)戊烷丙酸，乙醇酸，丙酮酸，乳酸，丙二酸，琥珀酸，蘋果酸，馬來酸，富馬酸，酒石酸，檸檬酸，苯甲酸，3-(4-羥基苯甲酰基)苯甲酸，肉桂酸，扁桃酸，甲磺酸，乙磺酸，1,2-乙二磺酸，2-羥基乙磺酸，苯磺酸，2-萘磺酸，4-甲基雙環(huán)-[2.2.2]辛-2-烯-1-羧酸，葡庚糖酸，4,4'-亞甲基雙-(3-羥基-2-烯-1-羧酸)，3-苯基丙酸，三甲基乙酸酸，叔丁基乙酸，月桂基硫酸，葡糖酸，谷氨酸，羥基萘甲酸，水楊酸，硬脂酸，粘康酸等。可接受的無機堿包括但不限于氫氧化鋁，氫氧化鈣，氫氧化鉀，碳酸鈉，氫氧化鈉等，或2)當存在于親本化合物中的酸性質子被金屬離子，例如堿金屬離子，堿土金屬離子或鋁離子置換時；或與有機堿配位。可接受的有機堿包括但不限于乙醇胺，二乙醇胺，三乙醇胺，氨丁三醇，N-甲基葡糖胺等。可接受的無機堿包括但不限于氫氧化鋁，氫氧化鈣，氫氧化鉀，碳酸鈉，氫氧化鈉等。本專利技術的鹽可以作為鹽分離或通過經(jīng)由添加酸或用酸性離子交換樹脂處理將pH降至pKa以下而轉化為游離酸。本文所述的途徑，代謝工程和培養(yǎng)策略依賴于使用例如脂肪酸O-甲基轉移酶從己酸產(chǎn)生己酸甲酯，并使用例如單加氧酶從己酸甲酯產(chǎn)生6-羥基己酸甲酯。可以使用例如脫甲基酶或酯酶從6-羥基己酸甲酯產(chǎn)生6-羥基己酸。本文所述的途徑，代謝工程和培養(yǎng)策略依賴于使用例如醇O-乙酰轉移酶產(chǎn)生己酸己酯，并使用例如單加氧酶從己酸己酯產(chǎn)生6-羥基己酸己酯，6-羥基己酸6-羥基己酯和/或己酸6-羥基己酯。可以使用例如酯酶從6-羥基己酸己酯和/或6-羥基己酸6-羥基己酯產(chǎn)生6-羥基己酸。可以使用例如酯酶從己酸6-羥基己酯和/或6-羥基己酸6-羥基己酯產(chǎn)生1,6-己二醇。來自聚羥基鏈烷酸酯累積細菌的與碳儲存本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術保護點】
在重組宿主中產(chǎn)生末端羥基(C

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2014.06.16 US 62/012,659;2014.06.16 US 62/012,666;1.在重組宿主中產(chǎn)生末端羥基(C3-8羥基烷基)-C(＝O)OCH3酯的方法，所述方法包括：a)將C4-9羧酸酶促轉化成(C3-8烷基)-C(＝O)OCH3酯；并且b)將(C3-8烷基)-C(＝O)OCH3酯酶促轉化成末端羥基(C3-8羥基烷基)-C(＝O)OCH3酯。2.權利要求1的方法，其中使用具有脂肪酸O-甲基轉移酶活性的多肽將C4-9羧酸酶促轉化成(C3-8烷基)-C(＝O)OCH3酯。3.權利要求2的方法，其中所述具有脂肪酸O-甲基轉移酶活性的多肽與SEQIDNO:22，SEQIDNO:23或SEQIDNO:24所示的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。4.權利要求1-3中任一項的方法，其中使用具有單加氧酶活性的多肽將(C3-8烷基)-C(＝O)OCH3酯酶促轉化成末端羥基(C3-8羥基烷基)-C(＝O)OCH3酯。5.權利要求4的方法，其中所述具有單加氧酶活性的多肽歸類在EC1.14.14.-或EC1.14.15.-下。6.權利要求4的方法，其中所述具有單加氧酶活性的多肽與SEQIDNO:13-15，SEQIDNO:27和/或SEQIDNO:28所示的氨基酸序列具有至少70％序列同一性。7.權利要求1-6中任一項的方法，其中從C4-9烷酰基(alkanoyl)-CoA酶促產(chǎn)生所述C4-9羧酸。8.權利要求7的方法，其中具有硫酯酶活性的多肽從C4-9烷酰基-CoA酶促產(chǎn)生所述C4-9羧酸。9.權利要求8的方法，其中所述具有硫酯酶活性的多肽與SEQIDNO:1，SEQIDNO:32或SEQIDNO:33所示的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。10.權利要求7的方法，其中具有丁醛脫氫酶活性的多肽和具有醛脫氫酶活性的多肽從C4-9烷酰基-CoA酶促產(chǎn)生所述C4-9羧酸。11.權利要求1-10中任一項的方法，所述方法還包括將末端羥基(C3-8羥基烷基)-C(＝O)OCH3酯酶促轉化成末端羥基C4-9羥基鏈烷酸(hydroxyalkanoate)。12.權利要求11的方法，其中具有脫甲基酶活性的多肽或具有酯酶活性的多肽將末端羥基(C3-8羥基烷基)-C(＝O)OCH3酯酶促轉化成末端羥基C4-9羥基鏈烷酸。13.權利要求1-12中任一項的方法，其中C4-9羧酸是己酸，并且酶促轉化成己酸甲酯；并且將所述己酸甲酯酶促轉化為6-羥基己酸甲酯。14.權利要求7-13中任一項的方法，其中所述C4-9烷酰基-CoA是己酰基-CoA，并且從己酰基-CoA酶促產(chǎn)生己酸。15.在重組宿主中產(chǎn)生一種或多種末端羥基取代的(C4-9烷基)-OC(＝O)-(C3-8烷基)酯的方法，所述方法包括：a)在所述宿主中將C4-9烷酰基-CoA酶促轉化成(C4-9烷基)-OC(＝O)-(C3-8烷基)酯；并且b)將(C4-9烷基)-OC(＝O)-(C3-8烷基)酯酶促轉化成(C4-9烷基)-OC(＝O)-(C3-8羥基烷基)酯，(C4-9羥基烷基)-OC(＝O)-(C3-8羥基烷基)酯，或(C4-9羥基烷基)-OC(＝O)-(C3-8烷基)酯中的任一種。16.權利要求15的方法，其中使用具有醇O-乙酰轉移酶活性的多肽將C4-9烷酰基-CoA酶促轉化成(C4-9烷基)-OC(＝O)-(C3-8烷基)酯。17.權利要求16的方法，其中所述具有醇O-乙酰轉移酶活性的多肽與SEQIDNO:25所示的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。18.權利要求15-17中任一項的方法，其中使用具有單加氧酶活性的多肽將(C4-9烷基)-OC(＝O)-(C3-8烷基)酯酶促轉化為(C4-9烷基)-OC(＝O)-(C3-8羥基烷基)酯，(C4-9羥基烷基)-OC(＝O)-(C3-8羥基烷基)酯或(C4-9羥基烷基)-OC(＝O)-(C3-8烷基)酯中的任一種。19.權利要求18的方法，其中所述具有單加氧酶活性的多肽歸類在EC1.14.14.-或EC1.14.15.-下。20.權利要求18或權利要求19的方法，其中所述具有單加氧酶活性的多肽與SEQIDNO:13-15，SEQIDNO:27和/或SEQIDNO:28所示的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。21.權利要求15-20中任一項所述的方法，所述方法還包括將(C4-9羥基烷基)-OC(＝O)-(C3-8羥基烷基)酯或(C4-9羥基烷基)-OC(＝O)-(C3-8烷基)酯酶促轉化為末端羥基C4-9羥基鏈烷酸。22.權利要求21的方法，其中具有酯酶活性的多肽將(C4-9羥基烷基)-OC(＝O)-(C3-8羥基烷基)酯或(C4-9羥基烷基)-OC(＝O)-(C3-8烷基)酯酶促轉化為C4-9羥基鏈烷酸。23.權利要求15-22中任一項的方法，其中所述C4-9烷酰基-CoA是己酰基-CoA，并且被酶促轉化成己酸己酯；并且使用具有單加氧酶活性的多肽將所述己酸己酯酶促轉化為6-羥基己酸己酯，6-羥基己酸6-羥基己酯或己酸6-羥基己酯中的任一種。24.權利要求23中任一項的方法，所述方法還包括將6-羥基己酸6-羥基己酯或6-羥基己酸己酯酶促轉化為6-羥基己酸。25.權利要求24的方法，其中具有酯酶活性的多肽將6-羥基己酸6-羥基己酯或6-羥基己酸己酯酶促轉化成6-羥基己酸。26.根據(jù)權利要求23-25中任一項的方法，所述方法還包括將6-羥基己酸6-羥基己酯或己酸6-羥基己酯酶促轉化為1,6-己二醇。27.權利要求26的方法，其中具有酯酶活性的多肽將6-羥基己酸6-羥基己酯或己酸6-羥基己酯酶促轉化為1,6-己二醇。28.權利要求26或權利要求27的方法，所述方法還包括將1,6-己二醇酶促轉化為6-羥基己酸。29.權利要求28的方法，其中具有醇脫氫酶活性的多肽和具有醛脫氫酶活性的多肽將1,6-己二醇酶促轉化為6-羥基己酸。30.權利要求13-14中任一項的方法，所述方法還包括將6-羥基己酸甲酯酶促轉化為6-羥基己酸。31.權利要求30的方法，其中具有脫甲基酶或酯酶活性的多肽將6-羥基己酸甲酯酶促轉化為6-羥基己酸。32.權利要求24-31中任一項的方法，所述方法還包括將6-羥基己酸酶促轉化為選自下組的產(chǎn)物：己二酸，己二酸半醛，6-氨基己酸，六亞甲基二胺和1,6-己二醇。33.權利要求32的方法，其中所述方法包括使用具有醇脫氫酶活性的多肽，具有6-羥基己酸脫氫酶活性的多肽，具有5-羥基戊酸脫氫酶活性的多肽，具有4-羥基丁酸脫氫酶活性的多肽或具有單加氧酶活性的多肽將6-羥基己酸酶促轉化為己二酸半醛。34.權利要求33的方法，所述方法還包括使用具有5-氧代戊酸脫氫酶活性的多肽，具有6-氧代己酸脫氫酶活性的多肽，具有7-氧代庚酸脫氫酶活性的多肽，具有醛脫氫酶活性的多肽或具有單加氧酶活性的多肽將己二酸半醛酶促轉化為己二酸。35.權利要求33的方法，所述方法還包括將己二酸半醛酶促轉化為6-氨基己酸。36.權利要求35的方法，其中具有ω-轉氨酶活性的多肽將己二酸半醛酶促轉化為6-氨基己酸。37.權利要求35或權利要求36的方法，所述方法還包括將6-氨基己酸酶促轉化為六亞甲基二胺。38.權利要求33的方法，所述方法還包括將己二酸半醛酶促轉化為六亞甲基二胺。39.權利要求37或權利要求38的方法，其中使用具有羧酸還原酶活性的多肽和/或具有ω-轉氨酶活性的多肽，和任選地具有N-乙酰轉移酶活性的多肽，具有乙酰腐胺脫乙酰酶活性的多肽和具有醇脫氫酶活性的多肽中的一種或多種將己二酸半醛或6-氨基己酸酶促轉化為六亞甲基二胺。40.權利要求39的方法，其中通過sfp的基因產(chǎn)物增強所述具有羧酸還原酶的多肽。41.權利要求39或權利要求40的方法，其中所述方法包括使用具有羧酸還原酶活性的多肽和具有醇脫氫酶活性的多肽將6-羥基己酸酶促轉化為1,6-己二醇。42.權利要求41的方法，所述方法還包括將1,6-己二醇酶促轉化為六亞甲基二胺。43.權利要求42的方法，其中具有醇脫氫酶活性的多肽和具有ω-轉氨酶活性的多肽將1,6-己二醇酶促轉化為六亞甲基二胺。44.權利要求32的方法，其中具有羧酸還原酶活性的多肽，具有ω-轉氨酶活性的多肽和具有醇脫氫酶活性的多肽將6-羥基己酸酶促轉化為六亞甲基二胺。45.權利要求36、39-40和43-45中任一項的方法，其中所述具有ω-轉氨酶活性的多肽與SEQIDNO.7-12所示的任一氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。46.權利要求14和23-45中任一項的方法，其中通過CoA依賴性碳鏈延長的兩個循環(huán)從乙酰基-CoA產(chǎn)生己酰基-CoA。47.權利要求46的方法，其中所述CoA依賴性碳鏈延長的兩個循環(huán)的每個包括使用(i)具有β-酮硫解酶活性的多肽或具有乙酰基-CoA羧化酶活性的多肽和具有β-酮脂酰基-[acp]合酶活性的多肽，(ii)具有3-羥基酰基-CoA脫氫酶活性的多肽或具有3-氧代酰基-CoA還原酶活性的多肽，(iv)具有烯酰基-CoA水合酶活性的多肽，和(v)具有反式-2-烯酰基-CoA還原酶活性的多肽以從乙酰基-CoA形成己酰基-CoA。48.酶促產(chǎn)生6-羥基己酸的方法，所述方法包括：a)使用具有脂肪酸O-甲基轉移酶活性的多肽將己酸酶促轉化為己酸甲酯；b)使用具有單加氧酶活性的多肽將己酸甲酯酶促轉化為6-羥基己酸甲酯；并且c)使用具有脫甲基酶活性的多肽或具有酯酶活性的多肽將6-羥基己酸甲酯酶促轉化為6-羥基己酸。49.酶促產(chǎn)生6-羥基己酸的方法，所述方法包括：a)使用具有醇O-乙酰轉移酶活性的多肽將己酰基-CoA酶促轉化成己酸己酯；b)使用具有單加氧酶活性的多肽將己酸己酯酶促轉化成6-羥基己酸己酯，己酸6-羥基己酯或6-羥基己酸6-羥基己酯；并且c)使用具有酯酶活性的多肽將6-羥基己酸己酯，己酸6-羥基己酯或6-羥基己酸6-羥基己酯酶促轉化為6-羥基己酸。50.權利要求1-49中任一項的方法，其中所述重組宿主經(jīng)受在需氧，厭氧，或微需氧培養(yǎng)條件下的培養(yǎng)策略。51.權利要求50的方法，其中所述重組宿主在營養(yǎng)物限制，如磷酸鹽，氮和氧限制的條件下培養(yǎng)。52.權利要求50或權利要求51的方法，其中使用陶瓷膜保留所述重組宿主以在發(fā)酵期間維持高細胞密度。53.權利要求50-52中任一項的方法，其中供給所述重組宿主的主要碳源源自生物原料。54.權利要求53的方法，其中所述生物原料是單糖，二糖，木質纖維素，半纖維素，纖維素，木質素，乙酰丙酸，甲酸，甘油三酯，甘油，脂肪酸，農(nóng)業(yè)廢物，濃縮酒糟(condenseddistillers’solubles)，或城市廢物。55.權利要求49-52中任一項的方法，其中供給所述重組宿主的主要碳源源自非生物原料。56.權利要求55的方法，其中所述非生物原料是或源自天然氣、合成氣、CO2/H2、甲醇、乙醇、苯甲酸鹽、來自環(huán)己烷氧化過程的非揮發(fā)性殘留物(NVR)堿洗液(causticwash)廢物流、或對苯二甲酸/異酞酸混合物廢物流。57.權利要求50-56中任一項的方法，其中所述重組宿主是原核生物。58.權利要求57的方法，其中所述原核生物來自選自下組的屬：埃希氏菌屬(Escherichia)；梭菌屬(Clostridia)；棒狀桿菌屬(Corynebacteria)；貪銅菌屬(Cupriavidus)；假單胞菌屬(Pseudomonas)；代爾夫特菌屬(Delftia)；芽孢桿菌屬(Bacilluss)；乳桿菌屬(Lactobacillus)；乳球菌屬(Lactococcus)；和紅球菌屬(Rh...

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：AL博特斯，AVE康拉迪，R哈杜奇，
申請(專利權)人：英威達技術有限責任公司，
類型：發(fā)明
國別省市：瑞士,CH