木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶變體以及編碼其的多核苷酸制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶變體。本發(fā)明專利技術(shù)還涉及編碼這些變體的多核苷酸，包含這些多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細(xì)胞；以及使用這些變體的方法。

Glucan endo transferase variants and polynucleotides encoding them

The present invention relates to variants of the endo glucan transferase. The present invention also relates to polynucleotides encoding these variants, nucleic acid constructs comprising these polynucleotides, vectors and host cells, and methods of using these variants.

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶變體以及編碼其的多核苷酸參照序列表本申請包含計(jì)算機(jī)可讀形式的序列表，將其通過引用結(jié)合在此。專利技術(shù)背景專利
本專利技術(shù)涉及木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶變體、編碼這些變體的多核苷酸、產(chǎn)生這些變體的方法以及使用這些變體的方法。相關(guān)領(lǐng)域描述木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶(XET)是一種催化木葡聚糖(植物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)多糖)的內(nèi)切-轉(zhuǎn)糖基作用的酶。該酶存在于大多數(shù)植物中，并且具體地是陸生植物。已經(jīng)從雙子葉植物和單子葉植物中提取出XET。還沒有在工業(yè)微生物中實(shí)現(xiàn)商業(yè)相關(guān)水平的木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶的異源表達(dá)。在本領(lǐng)域中，對改進(jìn)木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶在工業(yè)重要微生物中的表達(dá)存在需要。本專利技術(shù)提供了與其親本相比具有增加的表達(dá)產(chǎn)量的木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶變體。專利技術(shù)概述本專利技術(shù)涉及分離的木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶變體，這些變體包括與SEQIDNO:2的全長多肽的位置10、30、40、51、53、60、99、102、117、130、136、157、162、175、183、254、以及280相對應(yīng)的一個或多個(例如，若干個)位置處的取代，其中這些變體具有木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶活性。本專利技術(shù)還涉及編碼這些變體的分離的多核苷酸，包含這些多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細(xì)胞，以及產(chǎn)生這些變體的方法。本專利技術(shù)還涉及用于獲得這些變體的方法和增加木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)產(chǎn)量的方法。本專利技術(shù)進(jìn)一步涉及包括這些變體的組合物。附圖簡要說明圖1示出了pMMar27的限制性圖譜。圖2示出了pEvFz1的限制性圖譜。圖3示出了pDLHD0006的限制性圖譜。圖4示出了pDLHD0044的限制性圖譜。圖5示出了pDau571的限制性圖譜。圖6示出了pDLHD0075的限制性圖譜。圖7示出了pDLHD0095的限制性圖譜。定義等位基因變體：術(shù)語“等位基因變體”意指占用同一染色體位點(diǎn)的一種基因的兩個或更多個替代形式中的任一者。等位基因變異由突變天然產(chǎn)生，并且可以導(dǎo)致群體內(nèi)多態(tài)性。基因突變可以是沉默的(在所編碼的多肽中沒有改變)或可編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因變體是由基因的等位基因變體編碼的多肽。cDNA：術(shù)語“cDNA”意指可以通過從獲得自真核或原核細(xì)胞的成熟的、剪接的mRNA分子進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄而制備的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于對應(yīng)基因組DNA中的內(nèi)含子序列。早先的初始RNA轉(zhuǎn)錄本是mRNA的前體，其在呈現(xiàn)為成熟的剪接的mRNA之前要經(jīng)一系列的步驟進(jìn)行加工，包括剪接。編碼序列：術(shù)語“編碼序列”意指直接指明變體的氨基酸序列的多核苷酸。編碼序列的邊界一般由一個開放閱讀框架決定，該開放閱讀框架從一個起始密碼子(如ATG、GTG或TTG)開始并且以一個終止密碼子(如TAA、TAG或TGA)結(jié)束。編碼序列可以是基因組DNA、cDNA、合成DNA或其組合。控制序列：術(shù)語“控制序列”意指對于表達(dá)編碼本專利技術(shù)的變體的多核苷酸所必需的核酸序列。每個控制序列對于編碼該變體的多核苷酸來說可以是原生的(即，來自相同基因)或外源的(即，來自不同基因)，或相對于彼此是原生的或外源的。這些調(diào)控序列包括但不局限于前導(dǎo)子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。至少，控制序列包括啟動子，以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號。出于引入有利于將這些控制序列與編碼變體的多核苷酸的編碼區(qū)連接的特異性限制酶切位點(diǎn)的目的，這些控制序列可以提供有多個接頭。表達(dá)：術(shù)語“表達(dá)”包括涉及變體產(chǎn)生的任何步驟，包括但不限于，轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾以及分泌。表達(dá)載體：術(shù)語“表達(dá)載體”意指線性或環(huán)狀DNA分子，該分子包括編碼變體的多核苷酸并且該多核苷酸可操作地與提供用于其表達(dá)的控制序列相連接。片段：術(shù)語“片段”意指具有從成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一個或多個(例如，數(shù)個)的氨基酸的多肽；其中該片段具有木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶活性。在一個方面中，片段包含成熟多肽的至少85％、至少90％、或至少95％的氨基酸殘基。宿主細(xì)胞：術(shù)語“宿主細(xì)胞”意指易于用包含本專利技術(shù)的多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等的任何細(xì)胞類型。術(shù)語“宿主細(xì)胞”涵蓋由于復(fù)制期間發(fā)生的突變而與親本細(xì)胞不同的親本細(xì)胞的任何后代。改進(jìn)的特性：術(shù)語“改進(jìn)的特性”意指與變體相關(guān)的與親本相比得到改進(jìn)的特征。在本專利技術(shù)中，改進(jìn)的特性是相對于親本，變體的增加的表達(dá)產(chǎn)量。增加的表達(dá)產(chǎn)量：術(shù)語“增加的表達(dá)產(chǎn)量”意指相對于在相同的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)每升表達(dá)親本基因的相同的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的分泌的活性酶的量(g)，來自培養(yǎng)每升表達(dá)變體基因的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基的分泌的活性酶的更高量(g)。在一個方面中，與親本酶相比，該變體具有至少1.05、至少1.10、至少1.20、至少1.30、至少1.40、至少1.50、至少1.60、至少1.70、至少1.80、至少1.90、至少2、至少2.25、至少2.50、至少2.75、至少3.00、至少3.25、至少3.50、至少3.75、至少4、至少4.25、至少4.50、至少4.75、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、或至少10倍的增加的表達(dá)產(chǎn)量。分離的：術(shù)語“分離的”意指處于自然界中不存在的形式或環(huán)境中的物質(zhì)。分離的物質(zhì)的非限制性實(shí)例包括(1)任何非天然存在的物質(zhì)，(2)包括但不限于任何酶、變體、核酸、蛋白、肽或輔因子的任何物質(zhì)，該物質(zhì)至少部分地從與其本質(zhì)相關(guān)的一種或多種或所有天然存在的成分中去除；(3)相對于天然發(fā)現(xiàn)的物質(zhì)通過人工修飾的任何物質(zhì)；或(4)通過增加該物質(zhì)相對于與其天然相關(guān)的其他組分的量而修飾的任何物質(zhì)(例如，宿主細(xì)胞中的重組體產(chǎn)生；編碼該物質(zhì)的基因的多個拷貝；以及使用比編碼該物質(zhì)的基因天然相關(guān)的啟動子強(qiáng)的啟動子)。成熟多肽：術(shù)語“成熟多肽”意指在翻譯和任何翻譯后修飾如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后處于其最終形式的多肽。在一個方面中，基于預(yù)測SEQIDNO:2的氨基酸1至20是信號肽的SignalP3.0程序(本特森(Bendtsen)等人，2004，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)340:783-795)，該成熟多肽是SEQIDNO:2的氨基酸21至292。在另一個方面中，基于預(yù)測SEQIDNO:4的氨基酸1至27是信號肽的SignalP3.0程序，該成熟多肽是SEQIDNO:4的氨基酸28至287。在另一個方面中，基于預(yù)測SEQIDNO:6的氨基酸1至22是信號肽的SignalP3.0程序，該成熟多肽是SEQIDNO:6的氨基酸23至294。在另一個方面中，基于預(yù)測SEQIDNO:8的氨基酸1至24是信號肽的SignalP3.0程序，該成熟多肽是SEQIDNO:8的氨基酸25至297。在另一個方面中，基于預(yù)測SEQIDNO:10的氨基酸1至22是信號肽的SignalP3.0程序，該成熟多肽是SEQIDNO:10的氨基酸23至294。在另一個方面中，基于預(yù)測SEQIDNO:12的氨基酸1至26是信號肽的SignalP3.0程序，該成熟多肽是SEQIDNO:12的氨基酸27至285。在另一個方面中，基于預(yù)測SEQIDNO:14的氨基酸1至22是信號肽的SignalP3.0程序，該成熟多肽是SEQIDNO:14的氨基酸23至323。在另一個方面中，基于預(yù)測SEQID本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶變體，該變體包括與SEQ?ID?NO:2的全長多肽的位置10、30、40、51、53、60、99、102、117、130、136、157、162、175、183、254、以及280相對應(yīng)的一個或多個位置處的取代，其中該變體具有木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶活性，并且其中該變體與SEQ?ID?NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、或50的成熟多肽序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列一致性。

【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】2014.08.20 US 62/039,7441.一種木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶變體，該變體包括與SEQIDNO:2的全長多肽的位置10、30、40、51、53、60、99、102、117、130、136、157、162、175、183、254、以及280相對應(yīng)的一個或多個位置處的取代，其中該變體具有木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶活性，并且其中該變體與SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、或50的成熟多肽序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列一致性。2.如權(quán)利要求1所述的變體，該變體是親本木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶的變體，其中該親本選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：(a)一種多肽，該多肽與SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、或50的成熟多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少60％、至少80％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性；(b)一種由以下多核苷酸編碼的多肽，該多核苷酸在低嚴(yán)格條件下、中嚴(yán)格條件下、中-高嚴(yán)格條件下、高嚴(yán)格條件下、或非常高嚴(yán)格條件下與(i)SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、或49的成熟多肽編碼序列或者(ii)(i)的全長互補(bǔ)體雜交；(c)一種由以下多核苷酸編碼的多肽，該多核苷酸與SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、或49的成熟多肽編碼序列具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少60％、至少80％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性；以及(d)SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、或50的成熟多肽的片段，該片段具有木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶活性。3.如權(quán)利要求2所述的變體，該變體與該親本木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，但小于100％序列一致性。4.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的變體，其中取代的數(shù)目是1-17個，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17個取代。5.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的變體，該變體包括選自下組的一個或多個取代，該組由以下各項(xiàng)組成：I10A；P30E；A40G；S51T；I53A,V；Y60S；T99E,N；E102G；Q117E；K130R；R136W；Y157H；Y162C；N175S,G,Q；F183I；A254E；以及S280G,E。6.如權(quán)利要求5所述的變體，該變體包括A40G+N175...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：D·赫爾德，
申請(專利權(quán))人：諾維信公司，
類型：發(fā)明
國別省市：丹麥,DK