一種具有生產和回收纖維素葡聚糖苷酶雙重功能的酵母菌株的構建制造技術

本發明專利技術公開了一種具有生產和回收纖維素葡聚糖苷酶雙重功能的酵母菌株的構建，屬于酶工程領域。通過把釀酒酵母TDH3啟動子序列、釀酒酵母分泌信號肽編碼序列、煙曲霉纖維素葡聚糖苷酶編碼序列、釀酒酵母凝聚因子C端的400個氨基酸片段編碼序列、釀酒酵母TDH3終止子序列按順序合成，在兩端加上限制性內切酶位點，通過酶切構建到pPIC9K質粒中，再將該質粒轉化到酵母中得到具有生產和回收纖維素葡聚糖苷酶雙重功能的酵母菌株。其生產纖維素葡聚糖苷酶的回收率達到85%，發酵后的酶活達到1.5U/g濕酵母。本發明專利技術實現了纖維素葡聚糖苷酶生產和同步濃縮回收的一步完成，降低了能源消耗，降低了成本，具有較強的實用性。

【技術實現步驟摘要】
一種具有生產和回收纖維素葡聚糖苷酶雙重功能的酵母菌株的構建
本專利技術屬于酶工程領域，具體涉及一種具有生產和回收纖維素葡聚糖苷酶雙重功能的酵母菌株的構建。
技術介紹
纖維素是地球上最豐富的可再生資源，地球上每年因光合作用產生的纖維素達到100億噸左右，利用纖維素生產生物能源，是緩解能源危機，實現人類可持續發展的關鍵。纖維素利用的關鍵是把纖維素降解為可發酵性的糖類-葡萄糖。纖維素的降解需要外切酶、內切酶、葡聚糖苷酶的共同作用。其中葡聚糖苷酶降解葡萄糖的二聚體生產可發酵性的葡萄糖，是纖維素降解的關鍵步驟。用纖維素酶降解纖維素具有綠色、條件溫和、轉化率高的特點，但是纖維素較高的生產成本成為纖維素酶降解纖維素的瓶頸。液體發酵具有發酵體積大，易實現自動化控制等特點，被廣泛用來生產纖維素葡聚糖苷酶等。但是液體發酵生產的酶類產品濃度。生產的纖維素葡聚糖苷酶等都游離在發酵醪液中，為得到高濃度的纖維素葡聚糖苷酶或葡聚糖苷酶的固體粉末，需要對發酵醪液進行濃縮。為純化濃縮纖維素葡聚糖苷酶往往需要通過真空蒸發或噴霧干燥等工藝來濃縮纖。在纖維素蒸發濃縮或噴霧干燥的過程中，纖維素葡聚糖苷酶的活性喪失一部分，而且濃縮工藝大幅度提高了纖維素酶的生產成本。在蒸發或噴霧干燥的過程中，消耗大量的能源如電或燃氣等。因此濃縮成本，成為降低液體發酵生產纖維素葡聚糖苷酶生產成本的必然選擇。
技術實現思路
本專利技術的首要目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種具有生產和回收纖維素葡聚糖苷酶雙重功能的酵母菌株。本專利技術的另一目的在于提供用于構建上述酵母菌株的DNA片段。本專利技術的再一目的在于提供用于構建上述酵母菌株的質粒。本專利技術的目的還在于提供上述酵母菌株的構建方法。本專利技術的目的通過下述技術方案實現: 用于構建具有生產和回收纖維素葡聚糖苷酶雙重功能的酵母菌株的DNA片段，包括按順序排列的釀酒酵母TDH3啟動子序列、釀酒酵母分泌信號肽編碼序列、煙曲霉纖維素葡聚糖苷酶編碼序列、釀酒酵母凝聚因子C端的400個氨基酸片段編碼序列、釀酒酵母TDH3終止子序列；上述序列分別如SEQ ID N0.1~5所示。優選的，所述的用于構建具有生產和回收纖維素葡聚糖苷酶雙重功能的酵母菌株的DNA片段的序列如SEQ ID N0.6所示。用于構建具有生產和回收纖維素葡聚糖苷酶雙重功能的酵母菌株的質粒為包含上述DNA片段的真核表達質粒。所述的真核表達質粒優選為PPIC9K質粒。所述的用于構建具有生產和回收纖維素葡聚糖苷酶雙重功能的酵母菌株的質粒優選通過包含如下步驟的方法制備得到:合成兩端有限制性內切酶識別位點含有上述DNA片段的序列，通過限制性內切酶連接到真核表達質粒上。所述的真核表達質粒PPIC9K質粒時，限制性內切酶優選為Bgl II和FspA I。一種具有生產和回收纖維素葡聚糖苷酶雙重功能的酵母菌株，含有上述質粒。所述的酵母菌株優選為酵母菌株SMDl 168。所述的具有生產和回收纖維素葡聚糖苷酶雙重功能的酵母菌株的構建方法，包括如下步驟:制備酵母電轉化感受態細胞，將上述質粒通過電轉化轉進酵母中得到。本專利技術相對于現有技術具有如下優點和效果: 本專利技術的酵母菌株能在生產纖維素葡聚糖苷酶的同時，把纖維素葡聚糖苷酶吸收菌株自身表面，通過簡單過濾，就能達到濃縮纖維素葡聚糖苷酶的目的。本專利技術大大簡化了纖維素葡聚糖苷酶的濃縮工藝，降低了能源消耗，大幅度降低了成本，因此該專利技術具有較強的實用性。本專利技術把煙曲霉纖維素葡聚糖苷酶基因在酵母內表達，并實現了煙曲霉葡聚糖苷酶生產和同步濃縮回收的一步完成，現有未有相關報道，具有較高的創新型。本專利技術酵母菌株生產纖纖維素葡聚糖苷酶的回收率達到85%，發酵后葡聚糖苷酶的酶活達到1.5 U/g濕酵母。`【具體實施方式】下面結合實施例對本專利技術做進一步詳細的描述，但本專利技術的實施方式不限于此。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。實施例1 (l)pPIC9K質粒的提取 I)接1%含PPIC9K質粒的大腸桿菌細胞于2 mL LB培養基。2)37 °C振蕩培養 12 h。3)取1.5 mL菌液于EP管，以4000 rpm離心3 min,棄上清液。4)加 0.1 mL 溶液 I (1% 葡萄糖，50 mM EDTA pH 8.0,25 mM Tris-HCl pH 8.0)充分混合。5)加入0.2 mL溶液II (0.2 mM NaOH, 1% SDS),輕輕翻轉混勻，置于冰浴5 min。6)加入0.15 mL預冷溶液111(5 mol/L KAc, pH4.8),輕輕翻轉混勻,冰浴5 min。7)以10000 rpm離心20 min，取上清液于另一新EP管中。8)加入等體積的異戊醇，混勻后靜置10 min。9)再以 10000 rpm 離心 20 min,棄上清。10)用70%乙醇0.5 mL洗滌一次,抽干所有液體。11)待沉淀干燥后，溶于0.05 mL TE緩沖液中。(2)大腸桿菌DH5a感受態細胞的制備I)將大腸桿菌DH5a置于LB或其它營養豐富的培養基上，在37 °C下過夜培養。2)高溫滅菌大的離心瓶(250~500 mL)以備第二天搖瓶用。3)準備幾瓶滅菌水(總量約1.5升)，保存于冷凍室中以備第二天重懸浮細胞用。4)轉移0.2~I mL過夜培養物至裝有20 mL LB (或其他營養豐富的培養基)的100 mL搖瓶。5)37 1:下劇烈振蕩培養6小時。6)監控0D600值(培養I小時后每半小時測定一次)。7)當0D600值達到0.5~1.0時，從搖床中取出搖瓶，置于冰上冷卻15分鐘。8)細胞在4 V 5000g下離心15分鐘，棄上清液。9)用滅菌的冰水重懸浮細胞，先用渦旋儀或吸液管重懸浮細胞于少量體積中(幾毫升)，然后加水稀釋至離心管的2/3體積。10)照上面步驟重復離心，小心棄去上清液。11)照上面步驟用滅菌的冰水重懸浮細胞。12)離心，棄上清液。13)用20 mL滅菌的、冰冷后的10%甘油重懸浮細胞。14)照上面步驟離心，小心`棄去上清液(沉淀可能會很松散)。15)用10%甘油重懸浮細胞至最終體積為2~3 mL。16)將細胞按150 μ L等份裝入微量離心管，于-80 °C保存。(3)pPIC9K_GLU 質粒構建 I)用限制性內切酶Bgl I1、FspA I分別酶切質粒pPIC9K。限制性內切酶Bgl I1、FspA I(TAkaRA)各 1.5 μ?，提取的 pPIC9K 質粒溶液 6 μ?, IOXK Buffer WL 加入到 100 μ? EP管中，在30 °C水浴鍋中酶切60 min。再通過瓊脂糖凝膠電泳回收酶切的質粒pPIC9K。2)序列合成 合成兩端具有Bgl II和FspA I識別序列的序列GGAGATCTTCTAGACC -釀酒酵母TDH31啟動子序列-釀酒酵母分泌信號肽編碼序列-煙曲霉纖維素葡聚糖苷酶編碼序列-釀酒酵母凝聚因子C端的400個氨基酸編碼序列-釀酒酵母TDH3終止子序列-GGTGCGCACCC，各片段及全長片段如SEQ ID N0.1~6所示。3)連接 合成的堿基序列 20 μ?，酶切的 PPIC9K 質粒 5 μ?, IOXbuffer 5 μ?, dd本文檔來自技高網...

【技術保護點】
用于構建具有生產和回收纖維素葡聚糖苷酶雙重功能的酵母菌株的DNA片段，其特征在于：包括按順序排列的釀酒酵母TDH3啟動子序列、釀酒酵母分泌信號肽編碼序列、煙曲霉纖維素葡聚糖苷酶編碼序列、釀酒酵母凝聚因子C端的400個氨基酸片段編碼序列、釀酒酵母TDH3終止子序列。

【技術特征摘要】
1.用于構建具有生產和回收纖維素葡聚糖苷酶雙重功能的酵母菌株的DNA片段，其特征在于:包括按順序排列的釀酒酵母TDH3啟動子序列、釀酒酵母分泌信號肽編碼序列、煙曲霉纖維素葡聚糖苷酶編碼序列、釀酒酵母凝聚因子C端的400個氨基酸片段編碼序列、釀酒酵母TDH3終止子序列。2.根據權利要求1所述的DNA片段，其特征在于:所述的序列分別如SEQID N0.1~5所示。3.根據權利要求1所述的DNA片段，其特征在于:所述的DNA片段的序列如SEQIDN0.6所示。4.用于構建具有生產和回收纖維素葡聚糖苷酶雙重功能的酵母菌株的質粒，其特征在于:為包含權利要求1-3任一項所述的DNA片段的真核表達質粒。5.根據權利要求4所述的質粒,其特征在于:所述的真核表達質粒為pPIC9...

【專利技術屬性】
技術研發人員：薛棟升，汪江波，蔡鳳嬌，曹敬華，陳茂彬，方尚玲，鎮達，
申請(專利權)人：湖北工業大學，
類型：發明
國別省市：