一種基于微流控技術建立骨質疏松模型的方法技術

本發明專利技術提供了一種基于微流控技術建立骨質疏松模型的方法，該方法為：以聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane，PDMS)和玻璃作為芯片制作材料，選用小鼠胚胎成骨細胞MC3T3-E1細胞系作為基礎細胞并對其進行成骨分化誘導，利用灌流裝置對芯片內的誘導分化成骨細胞進行時間為24h、速度為0.1μl/min地塞米松培養液(濃度為10μmol/L)灌流處理，以此構建骨質疏松病例同時模型；另一方面利用灌流裝置對芯片內的誘導分化成骨細胞進行時間為24h、速度為0.1μl/min地塞米松和氯化鋰藥物(濃度為25mmol/L)灌流處理，以此構建骨質疏松治療模型；本方法建立的模型可以為組織工程、再生醫學等領域提供一個具有潛力的應用平臺，并且其具有操作簡單靈活、可控性強、自動化程度高、試劑消耗量小等優勢。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于微流控芯片技術、組織工程技術、再生醫學及其細胞學應用等領域，具體涉及一種基于微流控技術建立骨質疏松模型的方法。
技術介紹
骨質疏松是一種多病因起病，以單位體積內骨量減少、骨微結構破壞為特點的常見骨科代謝性疾病，在臨床上通常以骨骼疼痛、骨脆性增加、易發骨折為特征。骨質疏松癥可分為原發性、繼發性和特發性三大類。原發性骨質疏松癥約占骨質疏松癥的90％，分為Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型為絕經后骨質疏松(post-menopausalosteoporosis,PMOP)，Ⅱ型為老年性骨質疏松癥(senileosteoporosis,SOP)(程曉芝，閻東.骨質疏松癥的影像學診斷.新醫學，2007，38(1):11-13)。人的一生中，骨處于不斷更新狀態，破骨細胞清除舊骨(骨吸收)，繼之以成骨細胞填補新骨(骨形成)，稱為骨的重建。而當破骨細胞介導的骨吸收作用絕對或相對的增加超過成骨細胞的骨形成時則出現骨量持續丟失及骨密度的持續下降即骨質疏松發生(何偉濤，劉康，孫金胥，等.組織蛋白酶K與骨質疏松癥治療的研究進展.中國骨質疏松雜志，2008，14(9):671)。全世界約有2億多人口患有骨質疏松，僅在我國就有8800萬，其中中老年人、絕經后女性占絕大多數。而且隨著人口老齡化的加重，骨質疏松將會嚴重影響人們的生活健康。在過去十年，骨質疏松的病理過程被與組織、細胞和分子水平聯系在一起。作為“總開關”的信號整合了各種內分泌、神經內分泌、炎性及機械力的刺激作用。在細胞水平，主要骨細胞(骨形成成骨細胞、骨降解破骨細胞)的相互作用及偶聯形成了骨的最小功能單位，且有一些重要的分子在骨重建過程中協調著成骨細胞與破骨細胞間的活動。破骨細胞，起源于造血干細胞并與單核巨嗜細胞密切相關。成骨細胞，代表一類由骨髓間充質干細胞分化而成的骨形成細胞。其前體細胞向成熟成骨細胞(分泌可礦化基質)分化的速度和效率以及成骨細胞的壽命決定了骨形成的速率。目前，對于骨質疏松的治療仍缺乏有效的體外模型來深入研究其病理機理，同時更缺乏有效的治療的方案。微流控芯片技術近年來迅速被人們熟悉，并且正在向生物醫學領域滲透，突顯了其廣闊的應用前景，越來越多的研究者將微流控芯片技術作為生物醫學研究的重要實驗平臺，也逐漸滲入到一些臨床的研究中去。微流控芯片又稱芯片實驗室，是指一個幾平方厘米的芯片，用其微尺度空間在生物、化學等實驗中將所有功能集成在該芯片上的新型科學技術。微流控芯片技術的出現，已經被視為細胞研究所需要的新型重要技術平臺。它的主要特點和優勢是能將多種單元技術進行整合集成，具有可控性。生物醫學研究可在實際研究和需求中，結合基礎和臨床研究，設計和制備相關微流控芯片，能將此技術的發展帶入一個新的領域，也能使生物醫學研究中某些無法攻破的難題在微流控芯片的平臺下得到突破性的進展。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種基于微流控技術建立骨質疏松模型的方法，該方法解決了以往體外構建骨質疏松模型過程中存在的藥物濃度梯度生成不穩定、可控性差等問題。本專利技術提供了一種基于微流控技術建立骨質疏松模型方的法，該方法的具體步驟如下：——以SU8光刻膠為模板，以軟光刻法制作帶有樹形通道與細胞培養室的微流控芯片；微流控芯片由上層的PDMS和下層的玻璃片封接而成，帶有溶液進入口、濃度梯度生產單元、細胞培養室、廢液口及細胞接種口；溶液進入口連接濃度梯度生產單元，后與細胞培養室聯通，細胞培養室分別與廢液口和細胞接種口聯通；——誘導的成骨細胞通過細胞接種口和通道到細胞培養室，貼壁后用于實驗；——將兩個帶有泵的注射器連接于上述芯片的溶液進入口處，注射器內裝完全培養液和濃度為10μmol/L含地塞米松培養液，通過溶液進入口同時灌注24h，速度為0.1μl/min，液體經過濃度梯度形成部分后，六個細胞培養室中地塞米松的濃度將分別為0、2、4、6、8、10μmol/L；——待芯片內細胞貼壁、增殖后，將濃度為25mmol/L氯化鋰注入細胞；在細胞培養室內對細胞進行預處理1h，然后將含氯化鋰培養液和含有地塞米松和氯化鋰的培養液分別通過溶液進入口同時灌注24h，速度為0.1μl/min；——考察MC3T3-E1成骨細胞在芯片內的活性及增殖，并做統計分析。所述微流控芯片具有6個平行的細胞培養室，每個細胞培養室的大小為：長1200μm，寬1200μm，高150μm，容積大約為2μL，并帶有獨立的細胞接種口。所述的微流控芯片材料為PDMS和玻璃。利用地塞米松培養液和氯化鋰溶液構建骨質疏松病理和治療模型。所述微流控芯片樹形通道的結構可以根據兩個進樣口的溶液濃度通過多次流體分配形成濃度。由于微流控技術的靈活性，本方法可以根據溶液進入口溶液種類、特性，濃度設計多級混合通道等方法，從而實現復雜的藥物濃度梯度。細胞接種口可接種細胞懸液或含有細胞外基質的細胞混合液，來實現細胞2D和3D培養。本專利技術提供微流控技術建立骨質疏松的模型方法，是利用地塞米松培養液和氯化鋰溶液構建骨質疏松的病理和治療模型。地塞米松藥物的濃度為10μmol/L，氯化鋰藥物的濃度為25mmol/L。通過溶液進入口同時灌注24h，速度為0.1μl/min。本專利技術將微流控芯片作為主要技術平臺，用成骨細胞作為基礎細胞體外構建激素誘導的骨質疏松模型(GIOP)，并根據芯片的特點模擬出不同階段骨質疏松的狀態，觀察骨質疏松發生發展經過并對其進行治療。綜上所述，本專利技術提供了一種有效、操作靈活、可控性強的體外構建骨質疏松的方法，并且可以一步實現的生成帶有地塞米松梯度的方法，具有十分重要意義。本專利技術提供的提供微流控技術建立骨質疏松的模型方法，其優點在于1、可以通過一步法產生梯度的藥物濃度；2、藥物梯度分布的可控性強；3、與細胞培養室集成，可進行細胞二維和三維培養；4、操作簡單、快速、靈活且自動化程度高；5、可以通過集成化提高通量；6、試劑消耗量小。附圖說明圖1為基于微流控技術建立骨質疏松模型方法的微流控芯片示意圖；圖2為基于微流控技術建立骨質疏松模型方法的微流控芯片結構細節示意圖；其中1溶液進入口1，2溶液進入口2，3濃度梯度生產單元，4細胞培養室，5廢液口,6細胞接種口；圖3為基于微流控技術建立骨質疏松的模型方法產生的濃度梯度熒光表征圖；圖4為在微流控芯片上MC3T3-E1細胞藥物處理(地塞米松和氯化鋰)24小時后細胞增殖統計；圖5為在微流控芯片上MC3T3-E1細胞藥物處理(地塞米松和氯化鋰)24小時后細胞凋亡統計；圖6為成骨細胞堿性磷酸酶活性檢測。具體實施方式以下實施例將對本專利技術予以進一步的說明，但并不因此而限制本專利技術。實施例11.聚合物混合的微流控芯片的制作。使用傳統軟光刻法制作SU8負膠模板并通過灌注法得到相應的帶有通道的PDMS塊(單體：引發劑＝10：1)。芯片共有上下兩層：微流控芯片由上層的PDMS和下層的玻璃片封接而成，上層是通道層，下層是空白玻璃片，如圖1所示。帶有溶液進入口1和溶液進入口2、濃度梯度生產單元3、細胞培養室4、廢液口5及細胞接種口6；溶液進入口連接濃度梯度生產單元3，后與細胞培養室4聯通，細胞培養室4分別與廢液口5和細胞接種口聯通6；當兩種液體沿濃度梯度通道生產本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種基于微流控技術建立骨質疏松模型的方法，其特征在于：該方法的具體步驟如下：——以SU8光刻膠為模板，以軟光刻法制作帶有樹形通道與細胞培養室的微流控芯片；微流控芯片由上層的PDMS和下層的玻璃片封接而成，帶有溶液進入口、濃度梯度生產單元、細胞培養室、廢液口及細胞接種口；溶液進入口連接濃度梯度生產單元，后與細胞培養室聯通，細胞培養室分別與廢液口和細胞接種口聯通；——誘導的成骨細胞通過細胞接種口和通道到細胞培養室，貼壁后用于實驗；——將兩個帶有泵的注射器連接于上述芯片的溶液進入口處，注射器內裝完全培養液和濃度為10μmol/L含地塞米松培養液，通過溶液進入口同時灌注24h，速度為0.1μl/min，液體經過濃度梯度形成部分后，六個細胞培養室中地塞米松的濃度將分別為0、2、4、6、8、10μmol/L；——待芯片內細胞貼壁、增殖后，將濃度為25mmol/L氯化鋰注入細胞；在細胞培養室內對細胞進行預處理1h，然后將含氯化鋰培養液和含有地塞米松和氯化鋰的培養液分別通過溶液進入口同時灌注24h，速度為0.1μl/min；——考察MC3T3?E1成骨細胞在芯片內的活性及增殖，并做統計分析。

【技術特征摘要】
1.一種基于微流控技術建立骨質疏松模型的方法，其特征在于：該方法的具體步驟如下：——以SU8光刻膠為模板，以軟光刻法制作帶有樹形通道與細胞培養室的微流控芯片；微流控芯片由上層的PDMS和下層的玻璃片封接而成，帶有溶液進入口、濃度梯度生產單元、細胞培養室、廢液口及細胞接種口；溶液進入口連接濃度梯度生產單元，后與細胞培養室聯通，細胞培養室分別與廢液口和細胞接種口聯通；——誘導的成骨細胞通過細胞接種口和通道到細胞培養室，貼壁后用于實驗；——將兩個帶有泵的注射器連接于上述芯片的溶液進入口處，注射器內裝完全培養液和濃度為10μmol/L含地塞米松培養液，通過溶液進入口同時灌注24h，速度為0.1μl/min，液體經過濃度梯度形成部分后，六個細胞培養室中地塞米松的濃度將分別為0、2、4、6、8、10μmol/L；——待芯片內細胞貼壁、增殖后，將濃度為25mmol/L氯化鋰注入細胞；在細胞培養室內對細胞進行預處理...

【專利技術屬性】
技術研發人員：秦建華，石楊，
申請(專利權)人：中國科學院大連化學物理研究所，
類型：發明
國別省市：遼寧;21