一種水體微生物定性與定量的檢測方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種水體微生物定性與定量的檢測方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。所述方法包括以下步驟：確定待測樣品中的目標(biāo)微生物類群、目標(biāo)微生物和非目標(biāo)生物、以及不存在于所述待測樣品中的參考微生物；設(shè)計目標(biāo)微生物類群與目標(biāo)微生物的特征區(qū)域；設(shè)計特征區(qū)域的多重擴(kuò)增引物；在待測樣品中加入?yún)⒖嘉⑸锱c外源核酸后，提取待測樣品中的微生物的核酸；利用設(shè)計的多重引物擴(kuò)增微生物核酸，擴(kuò)增獲得特征測序片段；利用特征測序片段定性、定量分析待測樣品中微生物。本發(fā)明專利技術(shù)不需要對微生物進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)與增殖，可以一次性地對待測樣品中的多種已知微生物進(jìn)行高通量、高準(zhǔn)確度、高分辨率的檢測，檢測過程簡單、快速且流程規(guī)范。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及生物
，特別涉及一種水體微生物定性與定量的檢測方法。
技術(shù)介紹
水體微生物是水體質(zhì)量的指標(biāo)，也是人畜病原菌的重要來源，因此，水體微生物精確地定性與定量檢測與監(jiān)控是十分必要的。現(xiàn)有水體微生物定性與定量檢測技術(shù)包括形態(tài)學(xué)計數(shù)、芯片檢測、16SrRNA測序、宏基因組測序和實時定量PCR(PolymeraseChainReaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))。形態(tài)學(xué)計數(shù)檢測需要對微生物進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，耗時長，不可培養(yǎng)微生物不可檢測，一次僅能夠檢測一種微生物，通量低，在計數(shù)時抽樣量有限，且結(jié)果粗糙，無法對種以下的分類單元進(jìn)行區(qū)分。芯片檢測所需的待測樣品的DNA量大，需要對微生物進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)及富集處理，檢測結(jié)果不準(zhǔn)確，且無法做定量檢測。16SrRNA測序無法對種以下的分類單元進(jìn)行區(qū)分。宏基因組測序深度有限，對于低含量的微生物的定量檢測準(zhǔn)確度很差。實時定量PCR一次只能檢測一種微生物，通量低。另外，已有方法共有缺陷是，無法計算微生物定性與定量的可靠性，使得結(jié)論實用性差。
技術(shù)實現(xiàn)思路
為了解決現(xiàn)有技術(shù)中微生物定性與定量檢測不準(zhǔn)確的問題，本專利技術(shù)實施例提供了一種水體微生物定性與定量的檢測方法。所述技術(shù)方案如下：本專利技術(shù)實施例提供了一種水體微生物定性與定量的檢測方法，所述方法包括：確定待測樣品中的目標(biāo)微生物類群、目標(biāo)微生物和非目標(biāo)生物、以及不存在于所述待測樣品中的參考微生物，所述待測樣品為水體；根據(jù)所述目標(biāo)微生物類群、所述目標(biāo)微生物、所述參考微生物和所述非目標(biāo)生物的參考基因組序列，獲得所述目標(biāo)微生物類群的特征區(qū)域、所述目標(biāo)微生物的特征區(qū)域和所述參考微生物的特征區(qū)域；制備擴(kuò)增所述目標(biāo)微生物類群的特征區(qū)域的第一多重擴(kuò)增引物、擴(kuò)增所述目標(biāo)微生物的特征區(qū)域的第二多重擴(kuò)增引物和擴(kuò)增所述參考微生物的特征區(qū)域的第三多重擴(kuò)增引物，將所述第一多重擴(kuò)增引物、所述第二多重擴(kuò)增引物和所述第三多重擴(kuò)增引物混合得到混合多重擴(kuò)增引物；向所述待測樣品中加入所述參考微生物，獲得混合樣品；提取所述混合樣品的核酸；利用所述混合多重擴(kuò)增引物和所述混合樣品的核酸進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；利用所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量測序，獲得高通量測序片段；根據(jù)所述高通量測序片段，對所述目標(biāo)微生物類群和所述目標(biāo)微生物進(jìn)行定性和定量分析。具體地，所述目標(biāo)微生物類群的數(shù)目≥1個，且每個所述目標(biāo)微生物類群包括≥0種所述目標(biāo)微生物；所述目標(biāo)微生物為細(xì)菌、病毒、真菌、放線菌、立克次體、支原體、衣原體、螺旋體、藻類和原生動物中的至少一種；所述參考微生物為細(xì)菌、病毒、真菌、放線菌、立克次體、支原體、衣原體、螺旋體、藻類和原生動物中的至少一種。具體地，所述確定待測樣品中的非目標(biāo)生物的方法包括：將所述非目標(biāo)生物確定為除所述目標(biāo)微生物類群之外的所有生物，若能獲得所述目標(biāo)微生物類群的特征區(qū)域，則所述非目標(biāo)生物指除所述目標(biāo)微生物類群之外的所有生物；若不能獲得所述目標(biāo)微生物類群的特征區(qū)域，則所述非目標(biāo)生物指所述混合樣品中，除所述目標(biāo)微生物類群之外的其它生物。具體地，所述目標(biāo)微生物類群的特征區(qū)域為所述目標(biāo)微生物類群內(nèi)的微生物的參考基因組上的核酸序列；所述目標(biāo)微生物類群的特征區(qū)域的兩側(cè)的序列在所述參考基因組中為單一序列；所述目標(biāo)微生物類群的特征區(qū)域的兩側(cè)的序列在所述目標(biāo)微生物類群內(nèi)不同微生物間保守；所述目標(biāo)微生物類群的特征區(qū)域的區(qū)分度≥3；所述目標(biāo)微生物的特征區(qū)域與所述目標(biāo)微生物類群的特征區(qū)域同源；所述目標(biāo)微生物的特征區(qū)域的m2值≥2，其中，m2值為所述目標(biāo)微生物的特征區(qū)域與所述目標(biāo)微生物類群內(nèi)除所述目標(biāo)微生物外的其它所述微生物間的差異堿基數(shù)的最小值；所述參考微生物的特征區(qū)域為所述參考微生物的參考基因組上的核酸序列；所述參考微生物的特征區(qū)域的兩側(cè)的序列在所述參考微生物的參考基因組中為單一序列；所述參考微生物的特征區(qū)域的兩側(cè)的序列在除所述參考微生物外的其它生物中不具有同源性。進(jìn)一步地，所述區(qū)分度是指由同一所述混合多重擴(kuò)增引物擴(kuò)增的任一所述目標(biāo)微生物類群的特征區(qū)域與任一非特征區(qū)域間的差異堿基數(shù)的最小值，其中，所述非特征區(qū)域是所述混合多重擴(kuò)增引物以所述混合樣品的核酸為模板的擴(kuò)增產(chǎn)物，且所述非特征區(qū)域不為所述目標(biāo)微生物類群的特征區(qū)域，若無所述非特征區(qū)域，則所述區(qū)分度＝3×L1/4，其中，L1為所述目標(biāo)微生物類群的特征區(qū)域的核酸序列長度。具體地，在提取所述混合樣品的核酸時，若所述待測樣品中核酸的含量過低，則在提取所述混合樣品的核酸的過程中，加入所述混合多重擴(kuò)增引物不能擴(kuò)增的外源核酸。具體地，所述目標(biāo)微生物類群和所述目標(biāo)微生物的定性分析方法如下：將所述高通量測序片段與每種所述目標(biāo)微生物類群的特征區(qū)域進(jìn)行比對，當(dāng)差異堿基數(shù)≤n1時，則比對成功，相應(yīng)的所述高通量測序片段為所述目標(biāo)微生物類群的特征區(qū)域，其中，n1為所述目標(biāo)微生物類群的特征測序片段的最大容錯堿基數(shù)；若比對成功的所述目標(biāo)微生物類群的特征區(qū)域≥1種時，則判斷所述高通量測序片段為所述目標(biāo)微生物類群的特征測序片段；將所述目標(biāo)微生物的特征區(qū)域與每種同源的所述目標(biāo)微生物類群的特征區(qū)域進(jìn)行比對，在所述目標(biāo)微生物的特征區(qū)域中提取差異堿基組成所述目標(biāo)微生物的標(biāo)準(zhǔn)基因型；在所述目標(biāo)微生物類群的特征測序片段上，提取所述目標(biāo)微生物的標(biāo)準(zhǔn)基因型所對應(yīng)的堿基，組成所述目標(biāo)微生物的測試基因型；若所述目標(biāo)微生物的測試基因型與所述目標(biāo)微生物的標(biāo)準(zhǔn)基因型的差異堿基數(shù)≤n2，其中，n2為所述目標(biāo)微生物的特征測序片段的最大容錯堿基數(shù)，則所述目標(biāo)微生物的測試基因型所在的所述高通量測序片段為所述目標(biāo)微生物的特征測序片段；將所述參考微生物作為僅包含一個所述目標(biāo)微生物的所述目標(biāo)微生物類群，計算獲得的所述目標(biāo)微生物的特征測序片段，即為所述參考微生物的特征測序片段；若所述目標(biāo)微生物類群的特征測序片段存在的概率P5≥α5，則判斷所述待測樣品中存在所述目標(biāo)微生物類群，其中，α5為概率保障；若所述目標(biāo)微生物類群的特征測序片段存在的概率P5<α5，則判斷所述待測樣品中不存在所述目標(biāo)微生物類群；若所述目標(biāo)微生物的特征測序片段存在的概率P6≥α6，則判斷所述待測樣品中存在所述目標(biāo)微生物，其中，α6為概率保障；若所述目標(biāo)微生物的特征測序片段存在的概率P6<α6，則判斷所述待測樣品中不存在所述目標(biāo)微生物；n1使得P1≤α1且P3≤α3，其中，P1為一條不是所述目標(biāo)微生物類群的特征測序片段的所述高通量測序片段被誤判為所述目標(biāo)微生物類群的特征測序本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種水體微生物定性與定量的檢測方法，其特征在于，所述方法包括：確定待測樣品中的目標(biāo)微生物類群、目標(biāo)微生物和非目標(biāo)生物、以及不存在于所述待測樣品中的參考微生物，所述待測樣品為水體；根據(jù)所述目標(biāo)微生物類群、所述目標(biāo)微生物、所述參考微生物和所述非目標(biāo)生物的參考基因組序列，獲得所述目標(biāo)微生物類群的特征區(qū)域、所述目標(biāo)微生物的特征區(qū)域和所述參考微生物的特征區(qū)域；制備擴(kuò)增所述目標(biāo)微生物類群的特征區(qū)域的第一多重擴(kuò)增引物、擴(kuò)增所述目標(biāo)微生物的特征區(qū)域的第二多重擴(kuò)增引物和擴(kuò)增所述參考微生物的特征區(qū)域的第三多重擴(kuò)增引物，將所述第一多重擴(kuò)增引物、所述第二多重擴(kuò)增引物和所述第三多重擴(kuò)增引物混合得到混合多重擴(kuò)增引物；向所述待測樣品中加入所述參考微生物，獲得混合樣品；提取所述混合樣品的核酸；利用所述混合多重擴(kuò)增引物和所述混合樣品的核酸進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；利用所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量測序，獲得高通量測序片段；根據(jù)所述高通量測序片段，對所述目標(biāo)微生物類群和所述目標(biāo)微生物進(jìn)行定性和定量分析。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種水體微生物定性與定量的檢測方法，其特征在于，所述方法包括：
確定待測樣品中的目標(biāo)微生物類群、目標(biāo)微生物和非目標(biāo)生物、以及不存在于所述待
測樣品中的參考微生物，所述待測樣品為水體；
根據(jù)所述目標(biāo)微生物類群、所述目標(biāo)微生物、所述參考微生物和所述非目標(biāo)生物的參
考基因組序列，獲得所述目標(biāo)微生物類群的特征區(qū)域、所述目標(biāo)微生物的特征區(qū)域和所述
參考微生物的特征區(qū)域；
制備擴(kuò)增所述目標(biāo)微生物類群的特征區(qū)域的第一多重擴(kuò)增引物、擴(kuò)增所述目標(biāo)微生物
的特征區(qū)域的第二多重擴(kuò)增引物和擴(kuò)增所述參考微生物的特征區(qū)域的第三多重擴(kuò)增引物，
將所述第一多重擴(kuò)增引物、所述第二多重擴(kuò)增引物和所述第三多重擴(kuò)增引物混合得到混合
多重擴(kuò)增引物；
向所述待測樣品中加入所述參考微生物，獲得混合樣品；
提取所述混合樣品的核酸；
利用所述混合多重擴(kuò)增引物和所述混合樣品的核酸進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；
利用所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量測序，獲得高通量測序片段；
根據(jù)所述高通量測序片段，對所述目標(biāo)微生物類群和所述目標(biāo)微生物進(jìn)行定性和定量
分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述目標(biāo)微生物類群的數(shù)目≥1個，且每個
所述目標(biāo)微生物類群包括≥0種所述目標(biāo)微生物；
所述目標(biāo)微生物為細(xì)菌、病毒、真菌、放線菌、立克次體、支原體、衣原體、螺旋體、藻類
和原生動物中的至少一種；
所述參考微生物為細(xì)菌、病毒、真菌、放線菌、立克次體、支原體、衣原體、螺旋體、藻類
和原生動物中的至少一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述確定待測樣品中的非目標(biāo)生物的方法
包括：將所述非目標(biāo)生物確定為除所述目標(biāo)微生物類群之外的所有生物，若能獲得所述目
標(biāo)微生物類群的特征區(qū)域，則所述非目標(biāo)生物指除所述目標(biāo)微生物類群之外的所有生物；
若不能獲得所述目標(biāo)微生物類群的特征區(qū)域，則所述非目標(biāo)生物指所述混合樣品中，除所
述目標(biāo)微生物類群之外的其它生物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述目標(biāo)微生物類群的特征區(qū)域為所述目
標(biāo)微生物類群內(nèi)的微生物的參考基因組上的核酸序列；所述目標(biāo)微生物類群的特征區(qū)域的
兩側(cè)的序列在所述參考基因組中為單一序列；所述目標(biāo)微生物類群的特征區(qū)域的兩側(cè)的序
列在所述目標(biāo)微生物類群內(nèi)不同微生物間保守；所述目標(biāo)微生物類群的特征區(qū)域的區(qū)分度
≥3；
所述目標(biāo)微生物的特征區(qū)域與所述目標(biāo)微生物類群的特征區(qū)域同源；所述目標(biāo)微生物
的特征區(qū)域的m2值≥2，其中，m2值為所述目標(biāo)微生物的特征區(qū)域與所述目標(biāo)微生物類群內(nèi)
除所述目標(biāo)微生物外的其它所述微生物間的差異堿基數(shù)的最小值；
所述參考微生物的特征區(qū)域為所述參考微生物的參考基因組上的核酸序列；所述參考
微生物的特征區(qū)域的兩側(cè)的序列在所述參考微生物的參考基因組中為單一序列；所述參考
微生物的特征區(qū)域的兩側(cè)的序列在除所述參考微生物外的其它生物中不具有同源性。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述區(qū)分度是指由同一所述混合多重擴(kuò)增
引物擴(kuò)增的任一所述目標(biāo)微生物類群的特征區(qū)域與任一非特征區(qū)域間的差異堿基數(shù)的最
小值，其中，所述非特征區(qū)域是所述混合多重擴(kuò)增引物以所述混合樣品的核酸為模板的擴(kuò)
增產(chǎn)物，且所述非特征區(qū)域不為所述目標(biāo)微生物類群的特征區(qū)域，若無所述非特征區(qū)域，則
所述區(qū)分度＝3×L1/4，其中，L1為所述目標(biāo)微生物類群的特征區(qū)域的核酸序列長度。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括：
在提取所述混合樣品的核酸時，若所述待測樣品中核酸的含量過低，則在提取所述混
合樣品的核酸的過程中，加入所述混合多重擴(kuò)增引物不能擴(kuò)增的外源核酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述目標(biāo)微生物類群和所述目標(biāo)微生物的
定性分析方法如下：
將所述高通量測序片段與每種所述目標(biāo)微生物類群的特征區(qū)域進(jìn)行比對，當(dāng)差異堿基
數(shù)≤n1時，則比對成功，相應(yīng)的所述高通量測序片段為所述目標(biāo)微生物類群的特征區(qū)域，其
中，n1為所述目標(biāo)微生物類群的特征測序片段的最大容錯堿基數(shù)；若比對成功的所述目標(biāo)
微生物類群的特征區(qū)域≥1種時，則判斷所述高通量測序片段為所述目標(biāo)微生物類群的特
征測序片段；
將所述目標(biāo)微生物的特征區(qū)域與每種同源的所述目標(biāo)微生物類群的特征區(qū)域進(jìn)行比
對，在所述目標(biāo)微生物的特征區(qū)域中提取差異堿基組成所述目標(biāo)微生物的標(biāo)準(zhǔn)基因型；在
所述目標(biāo)微生物類群的特征測序片段上，提取所述目標(biāo)微生...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張靜，方治偉，彭海，
申請(專利權(quán))人：江漢大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：湖北;42