本發(fā)明專利技術(shù)提供了一種鑒定甘蔗抗褐銹病基因位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記方法，分別以待鑒定甘蔗和“POJ2878”的基因組DNA為模板，利用引物1和引物2進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物利用限制性核酸內(nèi)切酶HaeIII進(jìn)行酶切，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物，與抗褐銹病甘蔗品種POJ2878的酶切產(chǎn)物進(jìn)行比較，來(lái)判斷所待鑒定甘蔗的抗病性。本發(fā)明專利技術(shù)方法可用于甘蔗抗褐銹病基因的圖位克隆和分子標(biāo)記輔助選擇，通過(guò)檢測(cè)抗褐銹病基因位點(diǎn)來(lái)預(yù)測(cè)待鑒定甘蔗對(duì)褐銹病的抗性，不僅節(jié)約生產(chǎn)成本而且大大提高選擇效率，進(jìn)而加速甘蔗抗褐銹病育種進(jìn)程。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于甘蔗分子生物學(xué)及甘蔗抗性鑒定
更具體涉及一個(gè)與甘蔗抗褐銹病基因位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記鑒定方法，同時(shí)還涉及該分子標(biāo)記在甘蔗抗褐銹病育種中的應(yīng)用。
技術(shù)介紹
甘蔗是世界上最重要的糖料作物和重要的低碳經(jīng)濟(jì)作物，蔗糖長(zhǎng)期占世界食糖總產(chǎn)72%以上，其光合效率為C4作物之首，具有高光效特性、生長(zhǎng)巨型性、可多年宿根栽培和大量固定CO2等特性，在適宜條件下畝產(chǎn)糖可高達(dá)1噸以上，也是迄今生物量最高的栽培作物。我國(guó)為世界第三產(chǎn)糖國(guó)和第二食糖消費(fèi)國(guó)，蔗糖占我國(guó)食糖總產(chǎn)92%以上，甘蔗對(duì)保證我國(guó)食糖安全和發(fā)展低碳經(jīng)濟(jì)有不可替代的作用。根據(jù)ISSCT統(tǒng)計(jì)，甘蔗品種改良的科技貢獻(xiàn)率高達(dá)60%。但是，隨著甘蔗褐銹病的爆發(fā)和流行，致使一些豐產(chǎn)高糖當(dāng)家品種如Co475、T34362和CP78-1247被淘汰，極大地影響了蔗糖產(chǎn)業(yè)的持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展。由黑頂柄銹菌(PuccinamelanocephalaH.Sydow＆P.Sydow)引起的甘蔗褐銹病是一種重要的世界性甘蔗病害，嚴(yán)重危害甘蔗生長(zhǎng)，對(duì)蔗農(nóng)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該病自1890年在爪哇首次被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，隨后迅速擴(kuò)散到世界上多數(shù)植蔗國(guó)家和地區(qū)，在古巴、牙買加、澳大利亞、美國(guó)、墨西哥、印度、泰國(guó)和毛里求斯等植蔗國(guó)家和地區(qū)普遍發(fā)生，并多次暴發(fā)流行。我國(guó)臺(tái)灣1977年首次發(fā)生甘蔗銹病，1982年首次在中國(guó)大陸云南甘蔗種植區(qū)發(fā)現(xiàn)該病害，之后在福建、廣東、四川、江西和廣西等蔗區(qū)先后報(bào)道。目前，該病在國(guó)內(nèi)蔗區(qū)普遍發(fā)生和蔓延危害，造成甘蔗種質(zhì)退化、產(chǎn)量降低。發(fā)病田塊一般減產(chǎn)15％～30％，嚴(yán)重地塊減產(chǎn)幅度可達(dá)40％以上，蔗糖含量降低10％～36％。尤其近年，我國(guó)蔗區(qū)主栽的一批豐產(chǎn)高糖品種如“桂糖15”、“桂糖17”、“桂引9號(hào)”和主推品種“粵糖60號(hào)”和“德蔗03-83”等也因高度感染銹病而面臨淘汰。甘蔗銹病的流行與品種抗病性密切相關(guān)，大面積種植感病品種是病害流行的重要原因，選育和種植抗病品種是防治該病最經(jīng)濟(jì)有效的措施。而抗病種質(zhì)資源的發(fā)掘利用是抗病育種的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。目前，我國(guó)對(duì)甘蔗銹病抗病資源的篩選鑒定和評(píng)價(jià)還停留在人工接種表型觀察選擇，尚未開(kāi)展抗銹病基因標(biāo)記選擇研究。傳統(tǒng)的人工接種表型選擇抗病性的方法耗時(shí)、低效，鑒定結(jié)果易受病原和環(huán)境因素影響，難以滿足育種家對(duì)抗病育種要求。因此，為了保證國(guó)家的甘蔗產(chǎn)業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展的進(jìn)行，提高我國(guó)甘蔗生產(chǎn)技術(shù)水平，迫切需要建立一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、靈敏的鑒定甘蔗抗褐銹病方法，是甘蔗抗褐銹病分子育種最關(guān)鍵的技術(shù)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種鑒定甘蔗抗褐銹病基因位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記方法，鑒定或輔助鑒定甘蔗抗褐銹病的方法及其在甘蔗抗褐銹病育種中的應(yīng)用。本專利技術(shù)所提供的鑒定或輔助鑒定甘蔗抗褐銹病的方法，包括如下步驟：分別以待鑒定甘蔗和POJ2878的基因組DNA為模板，用由序列表中序列1和序列表中序列2所示的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物利用限制性核酸內(nèi)切酶HaeIII進(jìn)行酶切，通過(guò)電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，按照如下方法確定待鑒定甘蔗對(duì)褐銹病的抗性：如果待鑒定甘蔗的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶有與POJ2878帶型相同的條帶，且大小為389bp則待鑒定甘蔗為抗褐銹病甘蔗或候選為抗褐銹病甘蔗，如果待鑒定甘蔗的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶沒(méi)有與POJ2878帶型相同的條帶，則待鑒定甘蔗為非抗褐銹病甘蔗為或?yàn)楹蜻x非抗褐銹病甘蔗；所述待鑒定甘蔗為桂糖35和科5的雜交后代，上述方法中，所述待鑒定甘蔗具體選自桂糖35（抗褐銹?。┖涂?（感褐銹?。┑碾s種后代中的F1單株。在本專利技術(shù)的一個(gè)實(shí)施例中，所述待鑒定甘蔗具體選自桂糖35和科5的雜種后代中的F1單株。具體為：包括如下步驟：分別以待鑒定甘蔗和“POJ2878”的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增體系：2×PremixExTaqMixPCRBuffer12.5μL，10μmol/L引物1和引物2各0.5μL，25ng/μL模板DNA2μL，加滅菌雙蒸水使總體積為25μL；擴(kuò)增程序如下：94℃5min；94℃30S，56℃30S，72℃40S，34個(gè)循環(huán)；72℃7min。將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物利用限制性核酸內(nèi)切酶HaeIII進(jìn)行酶切，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物，按照如下方法確定待鑒定甘蔗對(duì)褐銹病的抗性：如果待鑒定甘蔗的酶切產(chǎn)物電泳條帶有與POJ2878帶型相同的條帶，則待鑒定甘蔗為抗褐銹病甘蔗，如果待鑒定甘蔗的酶切產(chǎn)物電泳條帶沒(méi)有與POJ2878帶型相同的條帶，則待鑒定甘蔗為非抗褐銹病甘蔗。酶切產(chǎn)物經(jīng)過(guò)膠回收及測(cè)序，該抗性片段大小為389bp，其余條帶為非特異性擴(kuò)增。所述引物1為：29-5’-TTTATAAATTACCATTAAGGACCAT-3’；所述引物2為：417-5’-CAGCATTTAAGATGGCATAGGCGTC-3’。本專利技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：本專利技術(shù)的引物對(duì)是與Bru1基因位點(diǎn)緊密連鎖的標(biāo)記，是基于PCR和酶切技術(shù)產(chǎn)生的共顯性標(biāo)記，因而可靠且使用方便，與以往的抗褐銹病標(biāo)記相比，具有與目標(biāo)基因Bru1緊密連鎖、準(zhǔn)確性高、檢測(cè)效率高、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。1.緊密連鎖：實(shí)驗(yàn)證明，利用本方法對(duì)甘蔗育種材料輔助鑒定的結(jié)果與抗性鑒定結(jié)果完全一致，表明該方法用于甘蔗抗褐銹病育種的分子標(biāo)記輔助選擇。2.準(zhǔn)確性高:與以往的抗褐銹病標(biāo)記相比，該檢測(cè)方法克服假陽(yáng)性高、穩(wěn)定性差等問(wèn)題。3.成本低廉：本研究使用限制性內(nèi)切酶HaeIII屬于廉價(jià)的四堿基內(nèi)切酶，而其他方法使用是昂貴的六堿基核酸內(nèi)切酶RsaI。本專利技術(shù)通過(guò)對(duì)甘蔗抗褐銹病基因的定位，開(kāi)發(fā)與其緊密連鎖的分子標(biāo)記方法，該方法可用于抗病基因的圖位克隆和分子標(biāo)記輔助選擇，通過(guò)檢測(cè)抗褐銹病基因位點(diǎn)來(lái)預(yù)測(cè)甘蔗對(duì)褐銹病的抗性，可以在甘蔗的實(shí)生苗階段進(jìn)行淘汰選擇，不僅節(jié)約生產(chǎn)成本而且大大提高選擇效率，進(jìn)而加速甘蔗抗褐銹病育種進(jìn)程。附圖說(shuō)明圖1PCR擴(kuò)增后直接進(jìn)行電泳分析結(jié)果。M:Marker,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10.分別代表甘蔗樣品編號(hào)為甘蔗品種POJ2878，云蔗91-510，云蔗03-194，柳城05-136，粵甘35號(hào)，崖城05-179和割手密福建89-1-1，云南合慶割手密，云南83-215，貴州78-2-04。圖2PCR產(chǎn)物利用RsaI酶切后進(jìn)行電泳分析結(jié)果。M:Marker,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10.分別代表甘蔗樣品編號(hào)為甘蔗品種POJ2878，云蔗91-510，云蔗03-194，柳城05-136，粵甘35號(hào)，崖城05-本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種用于鑒定甘蔗抗褐銹病基因位點(diǎn)緊密連鎖的引物，其特征在于：所述引物序列為引物1：29?5’?TTTATAAATTACCATTAAGGACCAT?3’；引物2：417?5’??CAGCATTTAAGATGGCATAGGCGTC?3’。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種用于鑒定甘蔗抗褐銹病基因位點(diǎn)緊密連鎖的引物，其特征在于：所述引物序列
為引物1：29-5’-TTTATAAATTACCATTAAGGACCAT-3’；引物2：417-5’-
CAGCATTTAAGATGGCATAGGCGTC-3’。
2.一種利用權(quán)利要求1所述的引物用于鑒定甘蔗抗褐銹病基因位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)
記方法，其特征在于：包括如下步驟：分別以待鑒定甘蔗和“POJ2878”的基因組DNA為模板，
PCR擴(kuò)增體系：2×PremixExTaqMixPCRBuffer12.5μL，10μmol/L引物1和引物2各0.5μ
L，25ng/μL模板DNA2μL，加滅菌雙蒸水使總體積為25μL；...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：郭晉隆，盧運(yùn)海，許莉萍，王恒波，闕友雄，劉迪，肖乃衍，陳平華，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：福建農(nóng)林大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：福建;35
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