用于工業(yè)規(guī)模分散的生物基質(zhì)支架制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供了用于工業(yè)規(guī)模分散的生物基質(zhì)支架。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2011年7月1日、申請(qǐng)?zhí)枮?01180042690.1、專利技術(shù)名稱為“用于工業(yè)規(guī)模分散的生物基質(zhì)支架”的PCT申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。優(yōu)先權(quán)聲明本申請(qǐng)?jiān)?5U.S.C.§119(e)下要求2010年7月2日提交的、序列號(hào)為61/360,939的美國臨時(shí)申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)，其全部?jī)?nèi)容通過引用并入本文。政府支持聲明本專利技術(shù)的各方面在國立衛(wèi)生研究院(NIH)資助號(hào)AA014243和IP30-DK065933、國立糖尿病、消化系統(tǒng)和腎病研究院(NIDDK)資助號(hào)DK34987、國立癌癥研究院(NCI)資助號(hào)CA016086和國立牙科和顱面研究所資助號(hào)DE019569的政府支持下做出。美國政府對(duì)本專利技術(shù)具有一定的權(quán)利。
本專利技術(shù)涉及生物基質(zhì)支架和產(chǎn)生生物基質(zhì)支架的方法，以及它們作為完整支架或作為以各種方式被切片或粉碎以及被分散以用于特定的實(shí)驗(yàn)和臨床用途的支架在不同應(yīng)用中的用途。
技術(shù)介紹
先體內(nèi)后體外(exvivo)或臨床項(xiàng)目如細(xì)胞療法中使用分化細(xì)胞的能力取決于維持具有成體表型并具有完全功能的細(xì)胞或能夠譜系限制干細(xì)胞或祖細(xì)胞(“干/祖細(xì)胞”)以實(shí)現(xiàn)該成體表型的能力。干細(xì)胞研究中正在進(jìn)行的革命已經(jīng)使得干/祖細(xì)胞群體包括來自胚胎、胎兒和出生后組織的那些的鑒定和分離成為可能1。針對(duì)所有成體細(xì)胞類型鑒定和分離干/祖細(xì)胞的能力以及使它們擴(kuò)增和分化的能力極大地增加了利用它們用于制藥學(xué)及其他工業(yè)研究項(xiàng)目、用于學(xué)術(shù)研究以及用于臨床項(xiàng)目諸如基于細(xì)胞的療法和組織工程的潛能2。目前用于先體內(nèi)后體外維持分化細(xì)胞或?qū)⒏杉?xì)胞譜系限制為成體命運(yùn)的方法是部分成功的，并且涉及將細(xì)胞鋪板在或嵌入一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)成分的基質(zhì)并嵌入對(duì)于所需成體表型定制的由特定激素、生長(zhǎng)因子、和營(yíng)養(yǎng)物組成的培養(yǎng)液中。對(duì)于非常原始的干細(xì)胞諸如胚胎干(ES)細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS)，或出生后衍生的可以轉(zhuǎn)變?yōu)槎喾N成體命運(yùn)的干細(xì)胞，諸如間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)或羊水來源干細(xì)胞(AFSC)，這些干細(xì)胞經(jīng)受可溶性信號(hào)和/或細(xì)胞外基質(zhì)成分的混合物，并必須經(jīng)數(shù)周時(shí)間以多組這樣的信號(hào)進(jìn)行處理。典型地，所實(shí)現(xiàn)的成體表型隨著每次制備是不同的，并具有某些成體特異基因的過表達(dá)或低表達(dá)和/或一種或多種成體組織特異性基因的異常調(diào)節(jié)。細(xì)胞外基質(zhì)由細(xì)胞分泌，在一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞表面上與它們鄰近，并且已經(jīng)長(zhǎng)期被理解為是對(duì)于細(xì)胞的結(jié)構(gòu)支持物7。它是由多種生物活性分子組成的極其復(fù)雜的支架，所述生物活性分子被高度調(diào)節(jié)，并且對(duì)于決定附著細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)和分化是關(guān)鍵的8。培養(yǎng)細(xì)胞的組織特異性基因表達(dá)通過在基質(zhì)提取物或純化的基質(zhì)成分上培養(yǎng)細(xì)胞來改善9。然而，個(gè)別基質(zhì)成分，單獨(dú)的或組合的，不能夠概括組織的復(fù)雜基質(zhì)化學(xué)和結(jié)構(gòu)。這與下列事實(shí)相關(guān)：基質(zhì)成分處于與自然組織區(qū)域以及與組織學(xué)結(jié)構(gòu)諸如血管相關(guān)的梯度中。組織基質(zhì)的這種復(fù)雜性更加容易通過對(duì)組織脫細(xì)胞化并留下基質(zhì)作為殘留物的提取法來實(shí)現(xiàn)10、11。然而，當(dāng)前的脫細(xì)胞化方案由于使用溶解基質(zhì)成分的基質(zhì)降解酶或緩沖液而導(dǎo)致一些基質(zhì)成分的大量流失。本專利技術(shù)提供了生物基質(zhì)支架以及制備和使用這樣的生物基質(zhì)支架的方法。本專利技術(shù)的方法導(dǎo)致產(chǎn)生富含組織的大部分膠原并具有結(jié)合基質(zhì)成分和基質(zhì)結(jié)合激素、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子的組織特異性提取物，所述膠原、結(jié)合基質(zhì)成分和基質(zhì)結(jié)合激素、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子對(duì)成熟細(xì)胞和干/祖細(xì)胞群體的譜系限制共同地產(chǎn)生重復(fù)性更高且更有效的分化效果。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)提供了由生物組織產(chǎn)生生物基質(zhì)支架的方法，所述生物基質(zhì)支架用于分散(例如，利用所述量，例如實(shí)施例2中所述的方案中所述的量的工業(yè)規(guī)模分散)至培養(yǎng)裝置上的方法，其包括：a)以包含約3.5MNaCl至約4.5MNaCl的鹽濃度的緩沖液灌注生物組織或使生物組織均質(zhì)化；b)在第一培養(yǎng)液中以包含脂肪酶和/或去污劑的脫脂緩沖液灌注步驟(a)的生物組織或提取步驟(a)的勻漿，其中所述第一培養(yǎng)液的重量摩爾滲透壓濃度是約250mOsm/kg至約350mOsm/kg，以及所述第一培養(yǎng)液是無血清的且處于中性pH；然后c)用處于中性pH且包含約2.0MNaCl至約5.0MNaCl的鹽濃度的緩沖液灌注步驟(b)的組織或提取步驟(b)的勻漿，選擇所述濃度以保持生物組織中鑒定的膠原不溶；然后d)在緩沖液中用核糖核酸酶(RNase)和脫氧核糖核酸酶(DNase)灌注步驟(c)的組織或提取步驟(c)的勻漿；以及然后e)用處于中性pH、無血清、且具有約250mOsm/kg至約350mOsm/kg的重量摩爾滲透壓濃度的第二培養(yǎng)液沖洗步驟(d)的組織或步驟(d)的勻漿，進(jìn)而從所述生物組織產(chǎn)生完整的或均質(zhì)化的生物基質(zhì)支架，所述生物基質(zhì)支架包含生物組織的至少95％的膠原和大部分膠原結(jié)合基質(zhì)成分以及基質(zhì)結(jié)合生長(zhǎng)因子、激素和細(xì)胞因子；f)在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中稀釋所述生物基質(zhì)支架；g)在約-80℃冷凍(f)的生物基質(zhì)支架；h)通過低溫研磨將(g)的生物基質(zhì)支架粉碎為約1μm至約100μm大小范圍的生物基質(zhì)顆粒；i)在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中懸浮解凍(h)的生物基質(zhì)顆粒；以及j)將步驟(i)的生物基質(zhì)顆粒分散至培養(yǎng)裝置上，進(jìn)而從生物組織產(chǎn)生生物基質(zhì)支架，所述生物基質(zhì)支架用于分散(例如，如本文所述的工業(yè)規(guī)模分散)至培養(yǎng)裝置上。本專利技術(shù)還提供了通過本專利技術(shù)方法產(chǎn)生的生物基質(zhì)支架。本專利技術(shù)的前述和其他方面現(xiàn)在將關(guān)于本文描述的其他實(shí)施方案來進(jìn)行更加詳細(xì)描述。應(yīng)該理解的是，本專利技術(shù)可以以不同形式體現(xiàn)，并且不應(yīng)該解釋為限于本文所述的實(shí)施方案。還有，提供這些實(shí)施方案，使得本公開將徹底且完整，并且將本專利技術(shù)的范圍充分地傳達(dá)給本領(lǐng)域技術(shù)人員。附圖簡(jiǎn)要說明圖1A-E1：大鼠肝臟生物基質(zhì)支架制備。(A)四步脫細(xì)胞化過程，包括灌注清洗、以PLA2和SDC脫脂、高鹽量清洗、以及核酸酶處理用于核酸去除。(B-D)在大鼠生物基質(zhì)支架制備中的四個(gè)階段。(B)在用基礎(chǔ)培養(yǎng)液灌注清洗10分鐘后，肝臟變得蒼白；(C)在脫脂期間，肝臟在GC下變得部分透明；(D)最終的完整支架在40分鐘灌注后看起來透明；(E)以低放大倍數(shù)顯示的生物基質(zhì)支架。(E1)用若丹明標(biāo)記的葡聚糖顆粒灌注的支架可視化表明了沿通道從大血管至細(xì)血管分支的漸增流量，且沒有泄露，表明支架中的專有脈管。在不同階段的生物基質(zhì)支架的相應(yīng)蘇木精和伊紅(H&E)染色表明，封裝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的組織學(xué)結(jié)構(gòu)如血管和網(wǎng)格狀基質(zhì)被保留，而細(xì)胞被去除。正常的大鼠肝門三聯(lián)管結(jié)構(gòu)由門靜脈(PV)、肝動(dòng)脈(HA)、和膽管(BD)組成(B1)；在脫細(xì)胞化過程期間本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
由生物組織產(chǎn)生生物基質(zhì)支架的方法，所述生物基質(zhì)支架用于工業(yè)規(guī)模分散至培養(yǎng)裝置上，所述方法包括：a)以包含約3.5M?NaCl至約4.5M?NaCl的鹽濃度的緩沖液灌注所述生物組織或使所述生物組織均質(zhì)化；然后b)在第一培養(yǎng)液中以包含脂肪酶和/或去污劑的脫脂緩沖液灌注步驟(a)的生物組織或提取步驟(a)的勻漿，其中所述第一培養(yǎng)液的重量摩爾滲透壓濃度是約250mOsm/kg至約350mOsm/kg，并且所述第一培養(yǎng)液是無血清的且處于中性pH；然后c)用處于中性pH且包含約2.0M?NaCl至約5.0M?NaCl的鹽濃度的緩沖液灌注步驟(b)的組織或提取步驟(b)的勻漿，選擇所述濃度以保持所述生物組織中鑒定的膠原不溶；然后d)在緩沖液中用RNase和DNase灌注步驟(c)的組織或提取步驟(c)的勻漿；以及然后e)用處于中性pH、無血清、且具有約250mOsm/kg至約350mOsm/kg的重量摩爾滲透壓濃度的第二培養(yǎng)液沖洗步驟(d)的組織或勻漿，進(jìn)而從所述生物組織產(chǎn)生完整的或均質(zhì)化的生物基質(zhì)支架，所述生物基質(zhì)支架包含所述生物組織的至少95%的膠原和大部分膠原結(jié)合基質(zhì)成分以及基質(zhì)結(jié)合生長(zhǎng)因子、激素和細(xì)胞因子；f)在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中稀釋所述生物基質(zhì)支架；g)在約?80℃冷凍(f)的生物基質(zhì)支架；h)通過低溫研磨將(g)的生物基質(zhì)支架粉碎為約1μm至約100μm大小范圍的生物基質(zhì)顆粒；i)在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中懸浮解凍(h)的生物基質(zhì)顆粒；以及j)將步驟(i)的生物基質(zhì)顆粒分散至培養(yǎng)裝置上，進(jìn)而從生物組織產(chǎn)生生物基質(zhì)支架，所述生物基質(zhì)支架用于工業(yè)規(guī)模分散至培養(yǎng)裝置上。...

【技術(shù)特征摘要】
2010.07.02 US 61/3609391.由生物組織產(chǎn)生生物基質(zhì)支架的方法，所述生物基質(zhì)支架用于工業(yè)規(guī)模分散至培養(yǎng)
裝置上，所述方法包括：
a)以包含約3.5MNaCl至約4.5MNaCl的鹽濃度的緩沖液灌注所述生物組織或使所述
生物組織均質(zhì)化；然后
b)在第一培養(yǎng)液中以包含脂肪酶和/或去污劑的脫脂緩沖液灌注步驟(a)的生物組織
或提取步驟(a)的勻漿，其中所述第一培養(yǎng)液的重量摩爾滲透壓濃度是約250mOsm/kg至約
350mOsm/kg，并且所述第一培養(yǎng)液是無血清的且處于中性pH；然后
c)用處于中性pH且包含約2.0MNaCl至約5.0MNaCl的鹽濃度的緩沖液灌注步驟(b)的
組織或提取步驟(b)的勻漿，選擇所述濃度以保持所述生物組織中鑒定的膠原不溶；然后
d)在緩沖液中用RNase和DNase灌注步驟(c)的組織或提取步驟(c)的勻漿；以及然后
e)用處于中性pH、無血清、且具有約250mOsm/kg至約350mOsm/kg的重量摩爾滲透壓濃
度的第二培養(yǎng)液沖洗步驟(d)的組織或勻漿，
進(jìn)而從所述生物組織產(chǎn)生完整的或均質(zhì)化的生物基質(zhì)支架，所述生物基質(zhì)支架包含所
述生物組織的至少95%的膠原和大部分膠原結(jié)合基質(zhì)成分以及基質(zhì)結(jié)合生長(zhǎng)因子、激素和
細(xì)胞因子；
f)在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中稀釋所述生物基質(zhì)支架；
g)在約-80℃冷凍(f)的生物基質(zhì)支架；
h)通過低溫研磨將(g)的生物基質(zhì)支架粉碎為約1μm至約100μm大小范圍的生物基質(zhì)顆
粒；
i)在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中懸浮解凍(h)的生物基質(zhì)顆粒；以及
j)將步驟(i)的生物基質(zhì)顆粒分散至培養(yǎng)裝置上，進(jìn)而從生物組織產(chǎn)生生物基質(zhì)支架，
所述生物基質(zhì)支架用于工業(yè)規(guī)模分散至培養(yǎng)裝置上。
2.權(quán)利要求1的方法，還包括對(duì)所述生物基質(zhì)支架消毒的步驟。
3.權(quán)利要求3的方法，其中所述消...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：ML羅亞奇，RH馬拉瓦卡，Y王，LCM里德，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：北卡羅來納查佩爾山大學(xué)，吉加塞特有限責(zé)任公司，
類型：發(fā)明
國別省市：美國;US