一種冰膠支架及其制備方法和用途技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種冰膠支架及其制備方法和應(yīng)用。所述冰膠支架的制備包括以下步驟：(a)將冰膠原料、氯化鈣各自配成溶液后，再混合制得到冰膠前體溶液；(b)將所得冰膠前體溶液注入模具中；(c)將裝載有所述冰膠前體溶液的模具進行梯度冷卻，得到預(yù)凝膠三維結(jié)構(gòu)體；(d)以真空冷凍干燥的方式干燥步驟(c)中得到的所述預(yù)凝膠三維結(jié)構(gòu)體，得到冰膠支架。所述支架具備水環(huán)境中透明、可溶解、大體積、機械性能好，可用于大規(guī)模的三維細胞培養(yǎng)。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及生物
，具體地，涉及一種冰膠支架及其制備方法和用途，更具體地，涉及可溶解、大體積、貫通性多孔冰膠組織工程支架及其制備方法，以及利用此冰膠支架大規(guī)模擴增細胞和無損收集細胞、構(gòu)建體外三維細胞培養(yǎng)微環(huán)境和體外三維類組織的方法，和將此類組織用于細胞生物學(xué)、組織工程、體外藥物檢測、病理學(xué)和藥理學(xué)研究的方法。
技術(shù)介紹
醫(yī)療行業(yè)目前面臨兩大難點問題：器官捐贈無法滿足臨床患者需求；新藥研發(fā)高投入、高風(fēng)險卻成功率低。因此，體外構(gòu)建大型化組織器官模型用于臨床移植、以及構(gòu)建細胞組織模型用于藥物篩選和評價，是再生醫(yī)學(xué)的迫切目標。不論哪一種研究，都需要首先實現(xiàn)對細胞的體外長時間大量培養(yǎng)。然而因體外缺乏血管網(wǎng)機制，無法持續(xù)滿足氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的有效輸送，體外細胞大量培養(yǎng)仍然止步不前。構(gòu)建體外細胞大量增殖培養(yǎng)的模式，是解決器官疾病、藥物篩選評價的基石，對發(fā)展再生醫(yī)療領(lǐng)域具有重要意義。再者，兩維細胞培養(yǎng)已經(jīng)發(fā)展了上百年，在各個生命科學(xué)領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用。但是兩維細胞培養(yǎng)存在許多固有的缺陷，為了彌補這些缺陷，近年來開始發(fā)展出了三維細胞培養(yǎng)技術(shù)。但是，三維細胞培養(yǎng)技術(shù)還存在許多問題，例如水凝膠型三維細胞培養(yǎng)機械性能差，不適合長期大規(guī)模培養(yǎng)，更無法用于反應(yīng)器培養(yǎng)，而支架型三維細胞培養(yǎng)的光學(xué)性能和結(jié)構(gòu)性能較差，透明度低，細胞裝載量小且遷移距離受限，并且常常無法溶解，導(dǎo)致在應(yīng)用中遇到很多困難。因此，急需開發(fā)出性能更加優(yōu)異的三維細胞培養(yǎng)技術(shù)，以滿足細胞培養(yǎng)、體外病理/藥理/生理細胞結(jié)構(gòu)體構(gòu)建、藥物檢測和組織工程與再生醫(yī)學(xué)的需要。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)提供了一種支架(例如細胞培養(yǎng)支架、組織工程支架等)及其制備方法，所述支架具備多種優(yōu)點，例如透明、可溶解、大體積、機械性能好，可用于大規(guī)模的三維細胞培養(yǎng)，例如在反應(yīng)器中的細胞培養(yǎng)。為了實現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)采用如下技術(shù)方案：一種冰膠支架(例如細胞培養(yǎng)支架、組織工程支架)的制備方法，其包括以下步驟：(a)將冰膠原料、氯化鈣各自配成溶液后，再混合制得到冰膠前體溶液；(b)將所得冰膠前體溶液注入模具中；(c)將裝載有所述冰膠前體溶液的模具進行梯度冷卻，得到預(yù)凝膠三維結(jié)構(gòu)體；(d)以真空冷凍干燥的方式干燥步驟(c)中得到的所述預(yù)凝膠三維結(jié)構(gòu)體，得到冰膠支架。采用上述方法所得的冰膠支架經(jīng)本領(lǐng)域常規(guī)紫外照射消毒后即可使用。所得冰膠支架具備多種優(yōu)點，例如透明、可溶解、大體積、機械性能好，可用于大規(guī)模的三維細胞培養(yǎng)，例如在反應(yīng)器中的細胞培養(yǎng)。本專利技術(shù)所述的冰膠支架制備方法中，在步驟(a)中，所述冰膠原料選自以下一種或多種物質(zhì)：明膠及其衍生物、海藻酸鹽(例如海藻酸鈉、海藻酸鈣)及其衍生物、瓊脂、基質(zhì)膠、膠原、蛋白多糖、糖蛋白、透明質(zhì)酸、殼聚糖、層粘連蛋白、纖維連接蛋白和纖維蛋白。其中，所述冰膠原料溶液的質(zhì)量濃度為1-20％；所述冰膠原料優(yōu)選海藻酸鈉，并配制成質(zhì)量濃度1％-5％，更優(yōu)選質(zhì)量濃度為2.5％。所述氯化鈣溶液的質(zhì)量濃度為0.1-4％；或者所述氯化鈣配制成濃度為5-30mM的溶液，優(yōu)選濃度為5-10mM，更優(yōu)選10mM。所述冰膠原料溶液與氯化鈣溶液混合體積比為(0.2-20):1，優(yōu)選(0.5-10):1，更優(yōu)選(1-5):1。本專利技術(shù)所述的冰膠支架制備方法中，在步驟(b)中，可通過注射器(例如1ml規(guī)格)將所得冰膠前體溶液注入模具中。本專利技術(shù)所述的冰膠支架制備方法中，在步驟(b)中，所述模具選自圓形培養(yǎng)皿、6孔板、12孔板、24孔板、48孔板、96孔板或384孔等規(guī)格的細胞培養(yǎng)板。本專利技術(shù)所述的冰膠支架制備方法中，在步驟(c)中，所述梯度冷卻為：將模具冷卻至2-6℃(例如約4℃)保存0.5-3h(例如約2小時)，繼續(xù)冷卻至-10--30℃(例如約-20℃)保存6-15h(例如8-12小時)。本專利技術(shù)所述的冰膠支架制備方法中，在步驟(d)中，所述真空冷凍干燥的溫度為：-20--40℃，優(yōu)選-25--35℃，更優(yōu)選-30℃；所述真空冷凍干燥的壓力為1-50Pa，優(yōu)選2-4Pa，更優(yōu)選3Pa；所述真空冷凍干燥的時間為20-40h，優(yōu)選24h。作為本專利技術(shù)優(yōu)選的實施方式，所述冰膠支架的制備方法包括如下步驟：(a)將質(zhì)量濃度2.5％海藻酸鈉溶液與10mM氯化鈣溶液以2:1的體積比例混合，得到冰膠前體溶液；(b)使用1ml一次性無菌注射器將所述冰膠前體溶液注入96孔板；(c)將裝載有所述冰膠前體溶液的96孔板冷卻至4℃并保存2-2.5小時，再于-20℃保存8-12小時，得到預(yù)凝膠三維結(jié)構(gòu)體；(d)將步驟(c)中得到的所述預(yù)凝膠三維結(jié)構(gòu)體在-30℃、3Pa的條件下進行真空冷凍干燥24h，得到冰膠支架。本專利技術(shù)還提供上述方法得到的冰膠支架。一些實施方案中，所述冰膠支架的孔隙率為10％-99％，例如20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或其任意區(qū)間。在一些實施方案中，所述冰膠支架的孔徑為1至300微米，例如5-250微米、10-250微米、20-200微米、50-200微米等。在一些實施方案中，所述冰膠支架的平均孔徑為1至300微米，例如5-250微米、10-250微米、20-200微米、50-200微米等。在一些實施方案中，所述冰膠支架是透明的，優(yōu)選地其透明度為20％-100％、30％-95％、40％-90％、50％-90％，例如20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或其任意區(qū)間。在一些實施方案中，所述冰膠支架的體積為0.01-1000mm3，優(yōu)選0.1-500mm3、0.2-400mm3、0.3-300mm3、0.4-200mm3、0.5-100mm3、1-100mm3、2-100mm3、或2-50mm3，例如0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、50、100、200、500mm3或其任意區(qū)間。在一些實施方案中，所述冰膠支架的吸水量為理論體積的1-15倍、1-10倍、1-5倍、1-3倍、2-10倍、2-5倍等。在一些實施方案中，所述冰膠支架裝載的細胞量為102/cm3-108/cm3，優(yōu)選104/cm3-108/cm3、105/cm3-108/cm3或106/cm3-108/cm3，例如102/cm3、103/cm3、104/cm3、105/cm3、106/cm3、107/cm3、108/cm3或其任意區(qū)間。在一些實施方案中，所述冰膠支架具有良好的彈性，例如具有0.1至10kPa的楊氏模量，例如0.1、0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10或其任意區(qū)間，在壓縮時，本專利技術(shù)的冰膠支架表現(xiàn)出至少60％、70％、80％、90％、95％、98％或者更高的壓縮應(yīng)變而不發(fā)生永久形變或者機械破壞，在外力撤除時仍能恢復(fù)原有的形狀；在一些實施方案中，所述冰膠支架具有良好的機械性能，例如本專利技術(shù)的冰膠支架相比于常規(guī)凝膠表述出更高的機械穩(wěn)定性。本專利技術(shù)還提供了上述方法所得冰膠支架在如下方面中的用途：(1)制備用于治療疾病或病癥的材料；(2)制備組織修復(fù)或再生的材料；(3本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種冰膠支架的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：(a)將冰膠原料、氯化鈣各自配成溶液后，再混合制得到冰膠前體溶液；(b)將所得冰膠前體溶液注入模具中；(c)將裝載有所述冰膠前體溶液的模具進行梯度冷卻，得到預(yù)凝膠三維結(jié)構(gòu)體；(d)以真空冷凍干燥的方式干燥步驟(c)中得到的所述預(yù)凝膠三維結(jié)構(gòu)體，得到冰膠支架。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種冰膠支架的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：(a)將冰膠原料、氯化鈣各自配成溶液后，再混合制得到冰膠前體溶液；(b)將所得冰膠前體溶液注入模具中；(c)將裝載有所述冰膠前體溶液的模具進行梯度冷卻，得到預(yù)凝膠三維結(jié)構(gòu)體；(d)以真空冷凍干燥的方式干燥步驟(c)中得到的所述預(yù)凝膠三維結(jié)構(gòu)體，得到冰膠支架。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，在步驟(c)中，所述梯度冷卻為：將裝載有所述冰膠前體溶液的模具冷卻至2-6℃保存0.5-3h，繼續(xù)冷卻至-10--30℃保存6-15h。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，在步驟(d)中，所述真空冷凍干燥的溫度為：-20--40℃，優(yōu)選-25--35℃，更優(yōu)選-30℃；所述真空冷凍干燥的壓力為1-50Pa，優(yōu)選2-4Pa，更優(yōu)選3Pa；所述真空冷凍干燥的時間為20-40h，優(yōu)選24h。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的制備方法，其特征在于，在步驟(a)中，所述冰膠原料選自以下一種或多種物質(zhì)：明膠及其衍生物、海藻酸鹽及其衍生物、瓊脂、基質(zhì)膠、膠原、蛋白多糖、糖蛋白、透明質(zhì)酸、殼聚糖、層粘連蛋白、纖維連接蛋白、纖維蛋白；其中，所述冰膠原料溶液的質(zhì)量濃度為1-20％，優(yōu)選1-5％；其中，所述氯化鈣溶液的質(zhì)量濃度為0.1-4％；其中，所述冰膠原料溶液與氯化鈣溶液混合體積比為(0.2-20):1，優(yōu)選(0.5-10):1，更優(yōu)選(1-5):1。5.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的制備方法，其特征在于，在步驟(b)中，所述...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：姚睿，孫偉，龐媛，
申請(專利權(quán))人：清華大學(xué)，上普博源北京生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：北京;11