一種提高肝素酶I活性的工程菌株構建方法技術

本發明專利技術涉及一種高活性的肝素酶I及其高效可溶性基因工程表達生產方法。依照肝素酶I的空間結構分析對其氨基酸序列進行優化，獲得比酶活提高48％的Hep169。然后根據密碼子偏愛性優化HepI169基因，通過人工合成獲得基因DNA，克隆到表達載體中與SUMO等標簽進行融合表達，轉化宿主細胞、篩選建立了Hep169的可溶性基因工程表達生產體系，分析結果顯示目的蛋白獲得了高效的可溶性表達，且具有很好的生物學活性，能高效的裂解肝素生成低分子量肝素。本發明專利技術方法不僅提供了一種高活性的HepI，而且為肝素酶I的高效可溶性基因工程表達生產提供了一種新方法，可有效降低低分子肝素等藥物的生產成本，具有廣泛的應用前景。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物醫藥領域，是一種高活性的肝素酶I及其高效可溶性基因工程表達生產方法。
技術介紹
肝素是動物體內一種天然抗凝血物質，一直被用做抗凝血的主要藥物，并且研究表明除了抗凝血活性及其相關的抗血栓形成活性以外，肝素還具有抑制平滑肌細胞增殖、抗炎癥、抗腫瘤和抗病毒等生物學功能。雖然肝素現仍用于臨床治療，但是其帶來的副作用也越來越明顯，例如肝素的長期使用容易引起大量出血，誘導血小板減少及血栓形成，影響血小板穩定及過敏反應等癥狀。而低分子量肝素以其注射吸收好、半衰期長、生物利用度高、出血副作用少等優點在臨床上的應用不斷擴大。截至目前為止，低分子量肝素已經逐步取代肝素成為了首選的治療藥物。低分子量肝素的生產可以分為化學降解法和酶解法。酶解法相對于化學降解法而言具有其獨特的優點，例如作用條件溫和，酶的專一性高，環境相對友好等，是較理想的工業生產低分子肝素的方法。但是利用酶解法生產低分子量肝素的缺點在于肝素酶(HepI)的來源有限，其野生菌產量很低并且需要價格昂貴的肝素進行誘導表達，從而導致生產成本過高。另一方面也是由于HepI的重組表達極易形成無活性的包涵體，并且不容易復性。我國是肝素原料的出口大國，但一直未能對低分子量肝素生產技術進行系統的研究。目前低分子量肝素主要來自合資企業生產或者由國外進口，因此，利用酶解法生產低分子量肝素的研究應用前景極為廣泛。而HepI作為低分子量肝素酶法生產的原材料，其高效生產技術的研究則受到廣泛關注。本研究采用融合表達HepI的形式來克服其容易形成包涵體的難題，同時結合生物信息學分析，對采取定點突變策略提高其酶活性，以達到其高效生產和利用的目的。
技術實現思路
本專利技術的目的在于克服當前肝素酶活性低的而缺點，提供一種高活性HepI及其高效可溶性基因工程表達方法，本專利技術獲得的工程菌可以可溶性表達高活性HepI，因此不但降低了包涵體在變復性過程中的酶活損失、縮短了生產工藝，降低了生產成本，便于更好的大規模工業化生產HepI，更能高效地用于低分子量肝素的工業化生產。本專利技術實現目的的技術方案如下：一種一種高活性的肝素酶I及其高效可溶性基因工程表達生產方法，其特征在于：改造獲得一種具有高活性的HepI突變體Hep169，然后利用分子生物學技術建立了它的高效可溶性基因工程表達體系。(1)依照HepI的空間結構分析，改造獲得一種比酶活較野生型提高48％的高活性肝素酶Hep169；(2)針對宿主密碼子偏愛性，對Hep169的編碼基因進行優化，以大腸桿菌為例，其優化后的序列如附錄序列表所示；(3)為實現高效可溶性基因工程表達，將Hep169與可促進二硫鍵形成、空間折疊的融合標簽進行融合表達，這些融合標簽包括SUMO、泛素、GST、Trx、DsbC、MBP等(4)為了確保融合標簽不影響Hep169的空間結構及活性，在肝素酶I基因的N端引入柔性linker，可用的柔性linker包括(G4S)n(n＝1-4)、GSGGSG、GSGGSGG、GSGGSGGG等。(5)為了在后續純化中切去融合標簽，在融合標簽與Hep169間引入了蛋白酶切割位點，可用的蛋白酶包括腸激酶、SUMO蛋白酶、凝血酶、TEV酶、Xa因子、3C蛋白酶等；(6)將重組質粒轉化至基因工程宿主菌，所述宿主菌包括大腸桿菌、酵母菌、乳酸菌、枯草芽孢桿菌等。(7)重組表達產物Hep169可高效裂解肝素生成低分子量肝素。本專利技術的有益效果和優點是：1、本專利技術的方法改造獲得了一種酶活顯著提高的HepI突變體Hep169，該突變體可明顯提高低分子肝素的酶解制備效率、并降低成本。2、成功實現了HepI169的高效基因工程表達，避免了包涵體變復性過程中對酶活造成的損失、縮短了HepI的生產工藝流程，降低了生產成本。3、本專利技術的重組Hep169具有可溶性好，活性高等優點，可以極大地發揮其在工業上高效生產低分子量肝素的目的。附圖說明(以SUMO融合的大腸桿菌表達質粒為例)圖1為本專利技術重組質粒PCR驗證圖，泳道1是以pESUMO為模板做的PCR結果，作為陰性對照，泳道2是G4S柔性linker-腸激酶切割位點(DDDDK)-HepI的PCR結果，作為陽性對照，泳道3是以構建的重組質粒pESUMO-HepI為模板做的PCR結果。圖2為HepI重組大腸桿菌的質粒提取驗證圖，泳道1是轉入PESUMO空質粒的大腸桿菌；泳道2是轉入pESUMO-HepI重組質粒的大腸桿菌，泳道3是轉入突變質粒pESUMO-HepI169的大腸桿菌。圖3為pESUMO-HepI169的突變位點測序結果。圖4為利用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測檢測肝素酶的表達，泳道1是以導入空載質粒的大腸桿菌做陰性對照，泳道2是未經突變的HepI，泳道3是突變的Hep169。圖5為HepI169的酶活檢測。具體實施方式下面通過具體實施例對本專利技術作進一步詳述，以下實施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本專利技術的保護范圍。本專利技術提供一種高活性的肝素酶I及其高效可溶性基因工程表達生產方法。具體內容包括：(1)依照HepI的空間結構分析，改造獲得一種比酶活較野生型提高48％的高活性肝素酶Hep169；(2)Hep169表達載體的構建：為實現高效可溶性基因工程表達，將Hep169與可促進二硫鍵形成、空間折疊的融合標簽進行融合表達，這些融合標簽包括SUMO、泛素、GST、Trx、DsbC、MBP等；為了確保融合標簽不影響Hep169的空間結構及活性，在肝素酶I基因的N端引入柔性linker，可用的柔性linker包括(G4S)n(n＝1-4)、GSGGSG、GSGGSGG、GSGGSGGG等；為了在后續純化中切去融合標簽，在融合標簽與Hep169間引入了蛋白酶切割位點，可用的蛋白酶包括腸激酶、SUMO蛋白酶、凝血酶、TEV酶、Xa因子、3C蛋白酶等；(3)將重組質粒轉化至基因工程宿主菌，所述宿主菌包括大腸桿菌、酵母菌、乳酸菌、枯草芽孢桿菌等。(4)重組表達產物Hep169的活性分析。結果顯示：本專利技術所獲得HepI突變體Hep169具有顯著高于野生型HepI的酶活，所建立的基因工程表達體系可實現Hep169的高效可溶性表達。本專利技術方法不僅為HepI的生產提供了一種新發方法，而且所獲得的高活性HepI-169可以更高效的用于低分子量肝素的工業化生產，這在醫藥工業方面具有廣泛的應用前景。一、高活性HepI的重組工程菌構建方法(以SUMO融合的大腸桿菌表達體系為例)，步驟如下：1、構建N端引入G4S柔性linker-腸激酶切割位點(DDDDK)序列的HepI基因以下表中引物進行PCR擴增，以肝素黃桿菌基因組DNA為模板，用P3、P4引物通過PCR擴增后獲得HepI基因序列，再以引物P1、P2(引入BsaI和BamHI酶切位點，下劃線部分)再次擴增獲得G4S柔性linker-腸激酶切割位點(DDDDK)-HepI，然后酶切、純化、連接到pESUMO質粒中，得到pESUMO-HepI質粒。具體體系及擴增條件如下：擴增HepI的PCR反應體系反應條件：2、HepI169重組質粒的構建將pESUMO-HepI質粒轉化大腸桿菌DH5α，在含有50μg/mL卡那霉素的LB培養基平板上，培養12h后挑取單克隆，提取質粒進行PCR本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種高活性的肝素酶I(HepI)及其高效可溶性基因工程表達生產方法，其特征在于：依照肝素酶I的空間結構分析，改造獲得一種比酶活較野生型提高48％的高活性肝素酶Hep169，然后利用分子生物學技術建立了Hep169的高效可溶性基因工程表達體系。

【技術特征摘要】
1.一種高活性的肝素酶I(HepI)及其高效可溶性基因工程表達生產方法，其特征在于：依照肝素酶I的空間結構分析，改造獲得一種比酶活較野生型提高48％的高活性肝素酶Hep169，然后利用分子生物學技術建立了Hep169的高效可溶性基因工程表達體系。2.根據權利要求1所述高活性肝素酶I，其氨基酸序列如附錄序列表所示。3.一種如權利要求1所述的Hep169高效可溶性基因工程表達體系，其特征在于：(1)針對宿主密碼子偏愛性，對Hep169的編碼基因進行優化，以大腸桿菌為例，其優化后的序列如附錄序列表所示；(2)為實現高效可溶性基因工程表達，將Hep169與可促進二硫鍵形成、空間折疊的融合標簽進行融合表達，...

【專利技術屬性】
技術研發人員：羅學剛，楊寶成，張同存，
申請(專利權)人：天津科技大學，
類型：發明
國別省市：天津;12