基于多重PCR的二代測序建庫技術制造技術

本發明專利技術涉及生物技術領域，特別涉及二代測序文庫構建技術。該方案中利用兩輪多重PCR來建庫。針對每個靶標區域或者靶標位點，設計兩條特異性引物，上游的引物OP用于第一輪多重PCR，下游的引物IP用于第二輪多重PCR。將第二輪PCR產物純化后，進行Q?PCR定量，稀釋到合適的濃度用于二代測序。本發明專利技術能夠有效的縮短Ampliseq試劑盒存在的問題，對于客戶定制化的panel設計生產周期只需要兩周，并降低單個樣本建庫的成本，且Ion?Torrent和Illumina測序平臺都通用。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及生物
，特別涉及二代測序文庫構建技術。
技術介紹
二代測序由于其超高的測序能力在科研和臨床中具有極為重要的應用。二代測序技術也稱深度測序、大規模平行測序，核心思想是邊合成邊測序(SequencingbySynthesis)，即通過捕捉新合成的末端的標記來確定DNA的序列，現有的技術平臺主要有Roche/454FLX、Illumina/SolexaGenomeAnalyzer和AppliedBiosystemsSOLIDsystem。這三個技術平臺各有優點，454FLX的測序片段比較長，高質量的讀長能達到400bp；Solexa測序性價比最高，不僅機器的售價比其他兩種低，而且運行成本也低，在數據量相同的情況下，成本只有454測序的1/10；SOLID測序的準確度高，原始堿基數據的準確度大于99.94％，而在15×覆蓋率時的準確度可以達到99.999％。Illumina/SolexaGenomeAnalyzer測序的基本原理是邊合成變測序。在Sanger等測序方法的基礎上，通過技術創新，用不同顏色的熒光標記四種不同的dNTP，當DNA聚合酶合成互補鏈時，每添加一種dNTP就會釋放出不同的熒光，根據捕捉的熒光信號并經過特定的計算機軟件處理，從而獲得待測DNA的序列信息。二代測序的一般流程如下：1)文庫制備，將DNA用霧化或超聲波隨機片段化成幾百堿基或更短的小片段。用聚合酶和外切核酸酶把DNA片段切成平末端，緊接著磷酸化并增加一個核苷酸黏性末端。然后將測序接頭與片段連接；2)簇的創建，將模板分子加入芯片用于產生克隆簇和測序循環。芯片有8個縱向泳道的硅基片。每個泳道內芯片表面有無數的被固定的單鏈接頭。上述步驟得到的帶接頭的DNA片段變性成單鏈后與測序通道上的接頭引物結合形成橋狀結構，以供后續的預擴增使用。通過不斷循環獲得上百萬條成簇分布的雙鏈待測片段；3)測序，DNA聚合酶結合熒光可逆終止子，熒光標記簇成像，在下一個循環開始前將結合的核苷酸剪切并分解；4)數據分析，測序得到的原始數據是長度為幾十個堿基的序列，要通過生物信息學工具將這些短的序列組裝成長的Contigs甚至是整個基因組的框架，或者把這些序列比對到已有的基因組或者相近物種基因組序列上，進一步分析得到有生物學意義的結果。聚合酶鏈反應(即PCR)是一種廣泛運用于分子遺傳和診斷的技術，用于放大擴增特定的DNA片段，可看作是生物體外的特殊DNA復制，可分析任何短的DNA序列，PCR的最大特點，是能將微量的DNA大幅增加，即使樣品中只含有低水平的DNA。PCR技術可用于擴增分析用的DNA或RNA選定片段。目前市場上最成功的商業化多重PCR建庫技術是ThermoFisher公司的Ampliseq技術，該技術可以在同一孔反應中完成上千對引物的擴增，使得多個靶標區域的富集可以通過一次PCR反應完成，隨后加上IonTorrent測序平臺的通用接頭建好文庫用于二代測序。然而，這個產品存在最大的缺陷是客戶定制化的panel設計生產周期較長，需要兩到三個月，嚴重的增加了時間成本；并且每個樣本的建庫費用高達1000-2000元，致使其經濟成本極高；另外該試劑盒只適用于IonTorrent測序平臺，受平臺因素影響大，亦不利于測序費用的降低。
技術實現思路
鑒于以上問題，本專利技術提供了一種基于多重PCR的二代測序建庫技術，該技術可以有效的解決Ampliseq試劑盒存在的問題，對于客戶定制化的panel設計生產周期只需要兩周，并且可以極大的降低單個樣本建庫的成本，且在IonTorrent和Illumina測序平臺都通用。為了實現上述專利技術目的，本專利技術提供以下技術方案：本專利技術中用到了兩輪多重PCR來建庫。首先針對每個靶標區域或者靶標位點，需要設計兩條特異性引物，一條引物在另一條引物的3’下游100-150bp的位置，處于下游的引物在5’端加上二代測序平臺通用的測序接頭。上游的引物OP用于第一輪多重PCR，下游的引物IP用于第二輪多重PCR。具體的建庫過程是：步驟1，將樣本DNA進行片段化處理，隨后每個片段兩端加上特殊的接頭；步驟2，加入第一輪擴增的上游引物混合池，與特殊接頭互補的通用引物，配制成PCR總體系，進行第一輪擴增；步驟3，將第一輪PCR產物純化后，加入第二輪擴增的下游引物混合池，與第二步中使用過的特殊接頭互補的通用引物配制成PCR總體系，進行第二輪擴增；步驟4，將第二輪PCR產物純化后，配置反應總體系，進行Q-PCR定量，稀釋到合適的濃度，即可用于二代測序。上述技術方案中，作為優選，步驟2中，第一輪特異性引物是普通的PCR擴增引物，共20個左右的堿基，Tm值設定在60℃，序列根據目標區域設計得到，多個引物混成一個OP引物池做為第一輪PCR的上游引物。PCR總體系為：2倍PCRMix35uL，10umol/LP71uL，1umol/LOP1uL或0.5umol/LOP2uL，DNA25uL。上述技術方案中，作為優選，步驟3中，第二輪特異性引物是普通的PCR擴增引物，在其5’端加上測序接頭5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’共80個左右的堿基，其中根據目標區域設計得到的序列長度是20個堿基左右，Tm值設定在60℃，多個引物混成一個IP引物池做為第二輪PCR的上游引物。P7的序列：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG3’。PCR總體系為：2倍PCRMix15uL，10umol/LP71uL，1umol/LOP1uL或0.5umol/LOP2uL，DNA5uL，NFW5uL。上述技術方案中，作為優選，所述步驟4中的PCR總體系10uL具體為：VAHTSSYBRqPCRMasterMix5uL，qPCRPrimerMix1uL，DNA2uL，ROXReferenceDye20.2uL，NFW5uL。上述技術方案中，作為優選，所述的第一輪PCR擴增循環數目為10-14。上述技術方案中，作為優選，所述的第二輪PCR擴增循環數目為10-14。本專利技術的優點和有益效果在于：提供一種基于多重PCR的二代測序建庫技術。在二代測序過程中采用該技術則不需要再購買商業的建庫試劑盒，所有反應試劑都可以單獨購買組合，極大的降低了實驗成本。另外由于在PCR過程中固定了一端的通用引物，極大的降低了多重PCR反應體系中的引物種類和數量，可以有效的抑制非特異性擴增和引物之間的相互干擾，也降低了不同引物間的擴增效率的差異。附圖說明為了更清楚地說明本專利技術實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本專利技術的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動性的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。圖1為兩輪多重PCR的二代測序建庫過程。圖2為10個樣本100SNPs平均覆蓋深度。具體實施方式下面結合附圖和實施例，對本專利技術的具體實施方式作進一步描述。以下實施例僅用于更加清楚地說明本專利技術的技術方案，而不能以此來限制本專利技術的保護范圍。實施例1.基因組DNA片段化a.打開Qsonica超聲破本文檔來自技高網...

【技術保護點】
二代測序文庫的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：步驟1，將樣本DNA進行片段化處理，隨后每個片段兩端加上特殊的接頭；步驟2，加入第一輪擴增的上游引物混合池，與特殊接頭互補的通用引物配制成PCR總體系，進行第一輪擴增；步驟3，將第一輪PCR產物純化后，加入第二輪擴增的下游引物混合池，與第二步中使用過的特殊接頭互補的通用引物配制成PCR總體系，進行第二輪擴增；步驟4，將第二輪PCR產物純化后，配制反應總體系，進行Q?PCR定量，稀釋到合適的濃度，即可用于二代測序。

【技術特征摘要】
1.二代測序文庫的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：步驟1，將樣本DNA進行片段化處理，隨后每個片段兩端加上特殊的接頭；步驟2，加入第一輪擴增的上游引物混合池，與特殊接頭互補的通用引物配制成PCR總體系，進行第一輪擴增；步驟3，將第一輪PCR產物純化后，加入第二輪擴增的下游引物混合池，與第二步中使用過的特殊接頭互補的通用引物配制成PCR總體系，進行第二輪擴增；步驟4，將第二輪PCR產物純化后，配制反應總體系，進行Q-PCR定量，稀釋到合適的濃度，即可用于二代測序。2.根據權利要求1所述的二代測序文庫的構建方法，其特征在于，所述步驟2中的PCR總體系具體為：2倍PCRMix35uL，10umol/LP71uL，1umol/LOP1uL，DNA25uL。3.根據權利要求1所述的二代測序文庫的構建方法，其特征在于，所述步驟2中的PCR總體系具體為：2倍PCRMix35uL，10umol/LP71uL，0.5umol/LOP2uL，DNA25uL。4.根據權利要求1所述的二代測序文庫的構建方法，其特征在于，所述步驟3中的PCR總體系具體為：2倍PCRMix15uL，10umol/LP71uL，1umol/LOP1uL，DNA5uL，NFW5uL。5.根據權利要求1所述的二代測序文庫的構建方法，其特征在于，所述步驟3中的PCR總體系具體為：2倍PCRMix15uL，10umol/LP71uL，0.5umol/...

【專利技術屬性】
技術研發人員：王筱恬，徐峰，
申請(專利權)人：上海美迪維康生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：上海;31