一種牛肝菌中煙堿的手性分析方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種牛肝菌中煙堿的手性分析方法，其特征在于：將牛肝菌樣品干燥、粉碎和過篩，加入萃取液萃取并過濾，經(jīng)自動固相微萃取后進行多維氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析，采用峰面積歸一化法定量檢測牛肝菌中S?(?)?煙堿和R?(+)?煙堿的比例。本方法提供的檢測方法，樣品處理簡單快捷，方法檢出限低，靈敏度高，精密度好，能夠滿足牛肝菌樣品中煙堿的手性分析。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及牛肝菌化學(xué)成分測定方法，具體涉及一種牛肝菌中煙堿的手性分析方法。
技術(shù)介紹
牛肝菌，又名白牛肝菌、大腳菇、黃蕎巴，是一種大型食用真菌。中國是牛肝菌的全球主要產(chǎn)區(qū)之一，據(jù)粗略統(tǒng)計，中國牛肝菌每年平均產(chǎn)量約5萬噸（鮮重），除少量內(nèi)銷外，絕大部分出口。中國牛肝菌的主銷市場是歐盟、瑞士、美國和中國香港等國家和地區(qū)，其中歐盟是中國牛肝菌產(chǎn)品的第一出口市場，約占整個出口市場份額的90%。然而自2008年9月1日起，德國率先執(zhí)行歐盟（EC）No.396/2005的規(guī)定，即牛肝菌樣品中煙堿限量標準為0.01mg/kg（折成干品為0.12mg/kg），歐盟其他進口商也紛紛要求增加對煙堿的抽檢。2008年11月17日，德國巴登符騰堡州內(nèi)政部從市場上抽查了26個牛肝菌樣品，其中22個樣品被檢出煙堿含量超標，這些被抽檢樣品大部分來自中國。雖然2010年4月，歐盟消費者保護總司以立法的形式對法案（EC）No.396/2005進行了修訂，將牛肝菌干品中煙堿的最高限量調(diào)整為2.3mg/kg，中國牛肝菌仍有部分產(chǎn)品煙堿含量超標。這一風波不僅嚴重影響了中國牛肝菌產(chǎn)品的出口，也引起了人們對通過牛肝菌攝入煙堿的健康風險的廣泛關(guān)注。煙堿，也叫尼古丁，是一種存在于茄科植物中的生物堿，也是煙草的重要成分，牛肝菌等野生菌類中也含有煙堿，中國國家質(zhì)檢總局對牛肝菌中煙堿來源的調(diào)查認為煙堿是真菌類物種生長過程中產(chǎn)生的一種普遍存在的次生代謝產(chǎn)物。煙堿分子含有一個手性中心，即四氫吡咯環(huán)上的2位碳原子，所以煙堿有兩個對映體：S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿。煙堿的兩個對映體具有完全不同含量、代謝機理和生理特性。S-(-)-煙堿的生理活性和毒性都要高于R-(+)-煙堿，例如相對于煙堿乙酰膽堿受體，S-(-)-煙堿比R-(+)-煙堿的親和性高10-100倍。因此進行牛肝菌中煙堿的手性分析對了解經(jīng)牛肝菌攝入煙堿的健康風險具有重要意義。目前關(guān)于煙堿的手性分析，主要是針對煙草和煙草制品中煙堿的手性分析方法研究，尚未有關(guān)于牛肝菌中煙堿的手性分析方法。牛肝菌中煙堿的含量遠低于煙草中的含量，這給牛肝菌中煙堿手性分析帶來了挑戰(zhàn)。因此有必要開發(fā)一種靈敏度高、精密度好、適合準確定量牛肝菌中S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿的方法。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)以煙堿為研究對象，對牛肝菌樣品進行了前處理方法研究，建立了基于自動固相微萃取-多維氣相氣質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)的牛肝菌中煙堿旋光異構(gòu)體的分析方法，實現(xiàn)了對牛肝菌中煙堿旋光對映體S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿的準確測定。本專利技術(shù)的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：一種牛肝菌中煙堿的手性分析方法，將牛肝菌樣品干燥、粉碎和過篩，加入萃取液萃取并過濾，經(jīng)自動固相微萃取后進行多維氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（MDGCMS）分析；具體步驟如下：1）標準溶液的配制：分別稱取100.0mg的S-(-)-煙堿標準品、50.0mg的R-(+)-煙堿標準品，用正己烷配制S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿濃度分別為100μg/mL和50μg/mL的混合標準溶液，濃度為100μg/mL的S-(-)-煙堿標準溶液，濃度為100μg/mL的R-(+)-煙堿標準溶液。2）牛肝菌樣品的混勻：將牛肝菌樣品置于40℃烘箱中，1小時后將牛肝菌樣品取出，粉碎后過0.45毫米孔徑標準篩；3）牛肝菌樣品的萃取：稱取約5g牛肝菌粉末，置于100mL錐形瓶中，加入20mL水，40mL正己烷和10mL2mol/L氫氧化鈉溶液，具塞震蕩萃取1h后，將萃取液避光靜置30min；取上層有機相，2000g離心10min后過0.22μm濾膜至螺紋瓶中待進樣。4)多維氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析：將步驟3）的過濾液再經(jīng)自動固相微萃取后進行多維氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析，具體條件如下：①自動固相微萃取條件：自動萃取纖維首次使用時需要進行老化，條件如下：固定相PDMS/DVB(聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯)，250℃老化30min；樣品加熱溫度30℃，預(yù)熱3min，萃取時間5min，解吸5min，進樣后在250℃烤針10min。②一維分析條件：色譜柱：30m×0.25mm×0.25μm5%二苯基-95%二甲基聚硅氧烷毛細管色譜柱(Rtx-5MS色譜柱或其他等效柱)。進樣口溫度：250℃。載氣：氦氣（純度≥99.999%)，恒壓進樣：117.9kPa。升溫程序：初始溫度80℃，平衡時間1min，以10℃/min的速率至200℃，保持10min。檢測器：火焰離子化檢測器（FID）；溫度：280℃；氫氣：40mL/min；空氣：400mL/min；尾吹：10mL/min；切割壓力為50.0kPa。③二維分析條件：色譜柱：30m×0.25mm×0.25μm環(huán)糊精毛細管色譜柱(InertCapCHIRAMIX色譜柱或其他等效柱)。升溫程序：初始溫度50℃，保持3min，以2℃/min的速率升至130℃，之后以3℃/min的速率升至180℃，保持1min。檢測器：電子轟擊源（EI）；離子源溫度：200℃；接口溫度：220℃；檢測器電壓相對于調(diào)諧結(jié)果0kV；溶劑延遲：3min；檢測模式：選擇離子檢測模式（SIM）；定量離子84。5）采用對照標樣與牛肝菌樣品煙堿色譜峰的保留時間及特征離子進行S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿的定性分析，對定量離子峰面積進行歸一化定量S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿占總煙堿的比例。本專利技術(shù)提供了一種牛肝菌中煙堿的手性分析方法，具有以下優(yōu)良效果：1.本專利技術(shù)方法采用液液萃取和固相微萃取的前處理方法，前處理過程簡單，操作簡便快速，且前處理效果較好。2.本專利技術(shù)方法采用多維氣相氣質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)，能實現(xiàn)對S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿的較好分離，R-(+)-煙堿的檢出限（LOD）為0.25%，能夠滿足牛肝菌樣品中煙堿的手性分析。3.本專利技術(shù)方法采用了高靈敏度和強抗干擾能力的質(zhì)譜進行檢測，因此具有操作準確、檢出限低、回收率及重復(fù)性好等優(yōu)點。附圖說明圖1為混合標準溶液的色譜圖，圖2為牛肝菌1#樣品的色譜圖。具體實施方式本專利技術(shù)通過以下具體實施例作進一步描述，但不限制本專利技術(shù)。1.儀器和試劑MDGCMS-QP2010Ultra多維氣質(zhì)聯(lián)用儀（日本島津公司），自動進樣器AOC-5000（日本島津公司），自動固相微萃取纖維進樣針，65μmPDMS/DVB（聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯）固定相萃取纖維頭（美國Supelco），Rtx-5MS色譜柱（30m×0.25mm×0.25μm，日本島津公司），InertCapCHIRAMIX色譜柱（30m×0.25mm×0.25μm，日本島津公司），AE163電子天平（感量：0.0001g，瑞士Mettler公司），HY-8調(diào)速振蕩器（常州國華電器有限公司），高速粉碎機（武漢銀彩科技有限公司），德國SIGMA3-30K-高速臺式冷凍型離心機。正己烷（色譜純），氫氧化鈉（分析純），S-(-)-煙堿標準品（CAS：54-11-5），R-(+)-煙堿標準品（CAS：25162-00-9）。2.標準溶液的配制稱取約100.0mg的S-(-)-煙堿標準品，用正己烷稀釋定容到50mL棕色容量瓶中，配制成濃度約為2.0mg/mL的S-(-)-煙堿標準儲備液；稱取約本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種牛肝菌中煙堿的手性分析方法，其特征在于：將牛肝菌樣品干燥、粉碎和過篩，加入萃取液萃取并過濾，經(jīng)自動固相微萃取后進行多維氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析，采用峰面積歸一化法定量檢測牛肝菌中S?(?)?煙堿和R?(+)?煙堿的比例；具體步驟如下：1)?標準溶液的配制：分別稱取100.0?mg的S?(?)?煙堿標準品、50.0?mg的R?(+)?煙堿標準品，用正己烷配制S?(?)?煙堿和R?(+)?煙堿濃度分別為100?μg/mL和50?μg/mL的混合標準溶液，濃度為100?μg/mL的S?(?)?煙堿標準溶液，濃度為100?μg/mL的R?(+)?煙堿標準溶液；2)牛肝菌樣品的混勻：將牛肝菌樣品置于40?℃烘箱中，1小時后將牛肝菌取出，粉碎后過0.45毫米孔徑標準篩；3)?牛肝菌樣品的萃取：稱取約5?g牛肝菌粉末，置于100?mL錐形瓶中，加入20?mL水，40?mL正己烷和10?mL?2?mol/L氫氧化鈉溶液，具塞震蕩萃取1?h后，將萃取液避光靜置30?min；取上層有機相，2000?g離心10?min后過0.22?μm濾膜至螺紋瓶中待進樣；4)?多維氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析，將步驟3）的過濾液再經(jīng)自動固相微萃取后進行多維氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析，具體條件如下：①自動固相微萃取條件：固定相：聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯?即PDMS/DVB；樣品加熱溫度30?℃，預(yù)熱3?min，萃取時間5?min，解吸5?min，進樣后在250?℃烤針10?min；②一維分析條件：色譜柱：30?m?×?0.25?mm?×?0.25?μm，?5%二苯基?95%二甲基聚硅氧烷毛細管色譜柱；進樣口溫度：250?℃。...

【技術(shù)特征摘要】
1.一種牛肝菌中煙堿的手性分析方法，其特征在于：將牛肝菌樣品干燥、粉碎和過篩，加入萃取液萃取并過濾，經(jīng)自動固相微萃取后進行多維氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析，采用峰面積歸一化法定量檢測牛肝菌中S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿的比例；具體步驟如下：1)標準溶液的配制：分別稱取100.0mg的S-(-)-煙堿標準品、50.0mg的R-(+)-煙堿標準品，用正己烷配制S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿濃度分別為100μg/mL和50μg/mL的混合標準溶液，濃度為100μg/mL的S-(-)-煙堿標準溶液，濃度為100μg/mL的R-(+)-煙堿標準溶液；2)牛肝菌樣品的混勻：將牛肝菌樣品置于40℃烘箱中，1小時后將牛肝菌取出，粉碎后過0.45毫米孔徑標準篩；3)牛肝菌樣品的萃取：稱取約5g牛肝菌粉末，置于100mL錐形瓶中，加入20mL水，40mL正己烷和10mL2mol/L氫氧化鈉溶液，具塞震蕩萃取1h后，將萃取液避光靜置30min；取上層有機相，2000g離心10min后過0.22μm濾膜至螺紋瓶中待進樣；4)多維氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析，將步驟3）的過濾液再經(jīng)自動固相微萃取后進行多維氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析，具體條件如下：①自動固相微萃取條件：固定相：聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯即PDMS/DVB；樣品加熱溫度30℃，預(yù)熱3min，萃取時間5min，解吸5min，進樣后在250℃烤針10min；②一維分析條件：色譜柱：30m×0.25mm×0.25μm，5%二苯基-95%二甲基聚硅氧烷毛細管色譜柱；進樣口溫度：250℃。2.載氣：氦氣，純度≥99.999%，恒壓進樣：117.9kPa；升溫程序：初始溫度80℃，平衡時間1min，以10℃/min的速率至200℃，保持10min；檢測器：火焰離子化檢測器（FID）；溫度：280℃；氫氣：40mL/min；空氣：...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：付亞寧，韓書磊，劉彤，陳歡，侯宏衛(wèi)，胡清源，
申請(專利權(quán))人：國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，
類型：發(fā)明
國別省市：河南;41