一種利用無菌藍莓組培苗采集菌根真菌的方法技術

本發明專利技術涉及一種利用無菌藍莓組培苗采集菌根真菌的方法，屬于植物菌根領域。該方法主要包括無菌藍莓組培苗瓶外生根培養、移栽培養、菌根真菌分離純化和保存、檢驗四個步驟。本發明專利技術所采用的方法是將沒有菌根真菌侵染的藍莓組培苗木直接栽種到具有藍莓菌根真菌的環境中，促使根系自然接種菌根真菌，然后再從根系上獲取菌根真菌。這種方法較常規的方法相比，省去了前期比較繁瑣的采樣、分離和接種過程，不僅明顯地縮短了采集菌根真菌所需要的時間，并且極大地減少了工作量。因此，此方法更便利快捷。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于植物菌根領域，具體涉及利用無菌藍莓組培苗采集菌根真菌的方法。
技術介紹
藍莓是杜鵑花科越桔屬植物，果實中含有豐富的抗氧化活性物質，尤其是花青苷種類多、含量高，可以促進視網膜細胞中的視紫質再生，改善重度近視，增進視力。近年來藍莓越來越受到廣大消費者的專注和歡迎，但在栽培中藍莓對土壤pH、有機質含量及養分等條件要求較高，其根系對土壤的適應情況受多種因素的影響，其中與菌根真菌的共生關系不可忽視。藍莓根系沒有根毛，自然條件下，藍莓根系通常易與相關真菌形成互利共生的關系，并通過歐石楠類真菌、暗生內格菌和叢枝菌等結構來實現這種互惠關系。大量研究證明杜鵑花類菌根可以促進宿主植物對營養元素的吸收，尤其是N、P、Cu、Zn、Fe、Mn的吸收都明顯增加，緩解環境脅迫，提高移栽成活率，增加移栽植物生長量，增強植物對重金屬的抵抗能力等作用。將有益的目標真菌用來開發藍莓菌根制劑的生產，將藍莓菌劑盡快運用到我國藍莓生產上，從而推動我國藍莓產業的快速發展。目前，常規的藍莓菌根真菌的獲取方法主要是通過從野生杜鵑花科植物或野生藍莓根系中采樣、分離并提純后得到。這種方法得到的根部微生物種類繁雜，不僅有可以侵染藍莓根系形成菌根的真菌種類，也包括其他非菌根真菌和微生物，需要進行多次接種和篩選，這樣不僅工作量比較大，獲得的菌根真菌也不一定是目標真菌。
技術實現思路
本專利技術試圖開發一種快速采集植物菌根真菌的新方法，這種方法不僅能夠準確快速地采集到促進藍莓生長的目標菌根真菌，而且還將省去傳統方法中復雜的分離、提取、接種和效果鑒定等步驟，可明顯提高菌根真菌的獲取效率。本專利技術的技術方案如下：一種利用無菌藍莓組培苗采集菌根真菌的方法，包括如下步驟：S1無菌藍莓組培苗瓶外生根培養(1)選取組培復壯苗，進行7-10天的煉苗處理，煉苗期間大棚溫度控制在25-30℃，4-6天后打開組培瓶蓋，再煉苗2-3天；(2)煉苗結束后，選用生長旺盛、粗壯的復壯苗，將沾帶的培養基清洗干凈，剪成3-4cm莖段浸潤生根液后，扦插到扦插基質中，置于拱棚中進行生根培養3周，拱棚薄膜上部使用透光率50％的遮蔭網覆蓋，拱棚中空氣濕度≥85％，拱棚內最高溫度控制在30℃以下，最低溫度不低于18℃；至扦插的莖段根萌發后揭去遮蔭網，再進行培養2-3周；所述的生根液為500mg/L吲哚乙酸水溶液；所述的扦插基質制備方法如下：將泥炭蘚采用0.1wt％的高錳酸鉀消毒，覆蓋薄膜密閉24h后裝入塑料穴盤作為扦插基質；S2移栽培養(1)將生根后的復壯苗移栽到無菌培養基質上，然后置于空氣濕度控制在80％-90％，溫度控制在24-28℃的溫室內培養3個月，待復壯苗長到9-11cm，取其根系鏡檢；(2)將鏡檢結果沒有被菌根真菌侵染的復壯苗根系用無菌培養基質包裹后，移栽到目標區域澆足水，生長2-3月；所述的目標區域為杜鵑花科植物的植株基部20-50cm的范圍內；S3菌根真菌分離純化和保存采用臺盼藍染色法對目標區域的藍莓根段進行鏡檢、并分離純化、保存菌根真菌；S4檢驗將步驟S3分離純化的真菌再次回接到無菌藍莓苗中進行驗證，驗證是否為目標真菌。進一步的，所述分離純化操作如下：(1)根段表面消毒：采集藍莓幼苗根系，清洗干凈，用75vt％酒精浸泡1min，再用無菌蒸餾水沖洗3次，然后用10vt％H2O2溶液侵泡15-20min，無菌蒸餾水沖洗3次；(2)菌根真菌培養和純化：把根段表面消毒后，剪成0.5-1cm根段，置于培養基中，置于25℃的恒溫培養箱中進行避光培養，待根段剪口處長出真菌后，挑取菌絲，再進行純化培養，直至每一個平皿中只含有單一菌落；進一步的，所述的杜鵑花科植物為藍莓。進一步的，所述的無菌培養基質為草炭土：松針：腐苔癬：腐殖土按照1：1:1:1混勻得到的混合物。本專利技術的有益效果如下：1、本專利技術提供的采集方法能夠快速采集到藍莓菌根真菌。常規的藍莓菌根真菌獲取方法主要通過從藍莓(或杜鵑花植物)的根系中采樣、分離并提純后得到。這種方式初次獲得的真菌種類比較多，既包括藍莓所需要的菌根真菌也包括其他非菌根真菌，需要再次將選出的真菌接種到沒有菌根真菌侵染的藍莓苗木上，然后再通過鏡檢加以確認。本專利技術所采用的方法是將沒有菌根真菌侵染的藍莓組培苗木直接栽種到具有藍莓菌根真菌的環境中，促使根系自然接種菌根真菌，然后再從根系上獲取菌根真菌。這種方法較常規的方法相比，省去了前期比較繁瑣的采樣、分離和接種過程，不僅明顯地縮短了采集菌根真菌所需要的時間，并且極大地減少了工作量。因此，此方法更便利快捷。2、本專利技術能夠更準確地采集到不同品種所需要的藍莓菌根真菌。較傳統的篩選菌根真菌方法相比，此方法省去了以往的從野外選菌、接種，最后篩選這樣的過程，更準確的、更快捷、更高效的采集到所需要的目標菌根真菌。附圖說明圖1為實施例采集得到的歐石楠類真菌；圖2為實施例采集得到的暗隔內生真菌；圖3為實施例采集得到的叢枝菌根真菌。具體實施方式下面結合具體實施例對本專利技術的技術方案作進一步的說明，但本專利技術不以任何形式受限于實施例內容。實施例中所述試驗方法如無特殊說明，均為常規方法；如無特殊說明，所述試劑和生物材料，均可從商業途徑獲得。實施例1在大連大黑山野外區域通過無菌藍莓組培苗定向采集杜鵑花科植株菌根真菌目標區域宿主植物：照白杜鵑藍莓組培苗品種：藍豐實驗地點：遼寧省大連市大黑山區域移栽時間：在大連地區野外環境下5-6月為移栽最佳季節一、無菌藍莓組培苗瓶外生根培養(1)在藍莓組培室選取組培復壯苗，進行7-10天的煉苗處理，煉苗期間大棚溫度控制在25-30℃，4-6天后打開瓶蓋，再煉苗2-3天；(2)煉苗結束后用鑷子將瓶苗取出，置于清水中，將沾帶的培養基清洗干凈，選用生長旺盛、粗壯的復壯苗，剪成3-4cm莖段浸潤生根液后，扦插到扦插基質中，置于育苗大棚中的小拱棚中進行生根培養3周，至扦插的莖段根萌發后揭去遮蔭網，再進行培養2-3周；在大棚內套有小拱棚(跨度1.5-1.8m，以便管理)小拱棚內通過噴霧保持85％以上的空氣濕度，且噴霧用水PH調整為5.0-5.5，溫度為25℃，小拱棚需用透光率50％的遮蔭網以覆蓋薄膜上部，連續覆蓋3周至扦插的莖段根萌發后揭去遮蔭網，揭開遮蔭網，培養20天。扦插基質制備方法如下：泥炭蘚，采用0.1wt％的高錳酸鉀消毒，覆蓋薄膜密閉24h后裝入塑料穴盤作為扦插基質；二、移栽培養(1)將生根后的復壯苗移栽到無菌培養基質上，然后置于空氣濕度控制在80％-90％，溫度控制在24-28℃的溫室內培養3個月，待復壯苗長到10cm，這時復壯苗根系生長旺盛，而且苗木處于半木質化狀態，對復壯苗根系進行鏡檢，確保復壯苗根系沒有被菌根真菌侵染；所述的無菌培養基質由草炭土：松針：腐苔癬：腐殖土按照1：1:1:1混勻，晾干后放入滅菌鍋中進行高溫高壓滅菌處理后(121℃,2h)，作為無菌培養基質；(2)將鏡檢結果沒有被菌根真菌侵染的復壯苗根系用無菌培養基質包裹后，移栽到目標區域澆足水，生長2-3月；包裹無菌培養基質一方面是促進移栽到目標區域的無菌藍莓苗更好生根，作為過渡區域，另一方面更容易讓目標真菌侵染于護根土里形成大量菌根真菌，移栽后澆足水，提高無菌藍莓苗木的成活率；所述的目標區域為照白杜鵑群落的植株基部20-50cm的范圍內；三、菌根本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種利用無菌藍莓組培苗采集菌根真菌的方法，其特征在于，包括如下步驟：S1無菌藍莓組培苗瓶外生根培養(1)選取組培復壯苗，進行7?10天的煉苗處理，煉苗期間大棚溫度控制在25?30℃，4?6天后打開組培瓶蓋，再煉苗2?3天；(2)煉苗結束后，選用生長旺盛、粗壯的復壯苗，將沾帶的培養基清洗干凈，剪成3?4cm莖段浸潤生根液后，扦插到扦插基質中，置于拱棚中進行生根培養3周，拱棚薄膜上部使用透光率50％的遮蔭網覆蓋，拱棚中空氣濕度≥85％，拱棚內最高溫度控制在30℃以下，最低溫度不低于18℃；至扦插的莖段根萌發后揭去遮蔭網，再進行培養2?3周；所述的生根液為500mg/L吲哚乙酸水溶液；所述的扦插基質制備方法如下：將泥炭蘚采用0.1wt％的高錳酸鉀消毒，覆蓋薄膜密閉24h后裝入塑料穴盤作為扦插基質；S2移栽培養(1)將生根后的復壯苗移栽到無菌培養基質上，然后置于空氣濕度控制在80％?90％，溫度控制在24?28℃的溫室內培養3個月，待復壯苗長到9?11cm，取其根系鏡檢；(2)將鏡檢結果沒有被菌根真菌侵染的復壯苗根系用無菌培養基質包裹后，移栽到目標區域澆足水，生長2?3月；所述的目標區域為杜鵑花科植物的植株基部20?50cm的范圍內；S3菌根真菌分離純化和保存采用臺盼藍染色法對目標區域的藍莓根段進行鏡檢、并分離純化、保存菌根真菌；S4檢驗將步驟S3分離純化的真菌再次回接到無菌藍莓苗中進行驗證，驗證是否為目標真菌。...

【技術特征摘要】
1.一種利用無菌藍莓組培苗采集菌根真菌的方法，其特征在于，包括如下步驟：S1無菌藍莓組培苗瓶外生根培養(1)選取組培復壯苗，進行7-10天的煉苗處理，煉苗期間大棚溫度控制在25-30℃，4-6天后打開組培瓶蓋，再煉苗2-3天；(2)煉苗結束后，選用生長旺盛、粗壯的復壯苗，將沾帶的培養基清洗干凈，剪成3-4cm莖段浸潤生根液后，扦插到扦插基質中，置于拱棚中進行生根培養3周，拱棚薄膜上部使用透光率50％的遮蔭網覆蓋，拱棚中空氣濕度≥85％，拱棚內最高溫度控制在30℃以下，最低溫度不低于18℃；至扦插的莖段根萌發后揭去遮蔭網，再進行培養2-3周；所述的生根液為500mg/L吲哚乙酸水溶液；所述的扦插基質制備方法如下：將泥炭蘚采用0.1wt％的高錳酸鉀消毒，覆蓋薄膜密閉24h后裝入塑料穴盤作為扦插基質；S2移栽培養(1)將生根后的復壯苗移栽到無菌培養基質上，然后置于空氣濕度控制在80％-90％，溫度控制在24-28℃的溫室內培養3個月，待復壯苗長到9-11cm，取其根系鏡檢；(2)將鏡檢結果沒有被菌根真菌侵染的復壯苗根系用無菌培養基質包裹后，移栽到目標區域澆足水，生長2-3...

【專利技術屬性】
技術研發人員：王賀新，閆東玲，婁鑫，徐國輝，趙麗娜，
申請(專利權)人：大連大學，
類型：發明
國別省市：遼寧;21