紫花苜蓿鐮刀菌根腐病病原菌分離純化與致病性鑒定方法技術

本發明專利技術公開了一種紫花苜蓿鐮刀菌根腐病病原菌分離純化與致病性鑒定方法，具體步驟包括苜蓿病株的采集與準備、病原菌的分離純化、病原菌形態學觀察、分子生物學鑒定、進化樹的構建和致病性鑒定。本發明專利技術對苜蓿根腐病病原的鑒定操作簡單、準確性高、簡便快速；分離純化純度高、鑒定結果可靠，通過致病性鑒定明確了各菌株的致病性強弱。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及植物病原菌分析領域，特別是涉及一種紫花苜蓿病原菌分離純化與致病性鑒定方法。
技術介紹
紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是世界上分布最廣泛的多年生豆科牧草，由于產量高、品質優良使其具有“牧草之王”之美譽。苜蓿的另一大優勢是一次種植可利用多年，由于利用年限較長，根腐病已成為產量下降和植株衰敗的一個極其重要的原因。該病害是世界性病害，幾乎在所有苜蓿產區都有發生，據估計，每年全世界由該病造成的產量損失在20％左右，有些嚴重發生的地塊甚至達到40％。隨著種植面積的增加和種植年限的延長，病害問題會越來越嚴重，不僅降低了苜蓿的產量，還降低了品質，有些甚至失去了加工和利用價值，同時也會給奶業帶來隱患，因為根腐病的主要致病菌，如鐮刀菌屬(Fusariumspp.)的三線鐮孢菌(F.tritinctum)和腐皮鐮孢菌(F.solani)等菌種可以產生毒素。其中，玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivaleno,DON)是較為常見、影響較大的兩種毒素。ZEN具有較強的生殖發育、免疫和細胞毒性，對腫瘤的產生也有一定影響；DON對人畜具有高度危害性，可致急性中毒癥狀。如果牛羊等家畜采食了含有這些毒素的苜蓿飼料，不僅對家畜本身帶來了影響，而且也會間接的對消費者帶來傷害。因此，苜蓿根腐病致病菌的分離鑒定對后續的防治及抗病品種的培育具有重要意義。由鐮刀菌引起的苜蓿根腐病迄今已在加拿大、美國、新西蘭、日本、澳大利亞等許多國家有所報道。該病對紫花苜蓿生長的各個時期均可造成嚴重危害。2003年，李敏權等對甘肅定西苜蓿根腐病的病原研究中發現了3種鐮刀菌，即尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)、銳頂鐮刀菌(F.acuminatum)和半裸鐮刀菌(F.semitectum)，這是我國首次對該病病原系統的研究報道。我國關于苜蓿根腐病的研究過去一直集中在田間癥狀、防治等方面，對病原系統的研究報道不多。另外，鐮刀菌是真菌中最難鑒定和最具經濟價值的屬之一，形態復雜，又易受外界環境影響發生變異，通過形態學觀察很難準確鑒定到種。因此，亟需專利技術一種快速、簡便的對苜蓿根腐病及其他病原進行精準鑒定的方法。
技術實現思路
本專利技術要解決的技術問題是提供一種紫花苜蓿鐮刀菌根腐病病原菌分離純化與致病性鑒定方法。本專利技術所述的紫花苜蓿鐮刀菌根腐病病原菌分離純化與致病性鑒定方法，包括以下步驟：(1)苜蓿病株的采集與準備對苜蓿田進行定點調查，觀察根腐病的田間癥狀，采集具有典型癥狀的鐮刀菌根腐病病株標樣；(2)病原菌的分離純化于病株標樣的病斑處切取小塊組織，經處理后，純化到種，再將分離純化后的鐮刀菌接到培養基中保存，用于后續的菌種鑒定；(3)病原菌形態學觀察菌種培養一段時間后，依據培養基上的培養性狀，包括菌落形態、色澤、菌落生長速度；通過VBC和SNA限定營養缺乏培養基上對大小分生孢子的有無、分生孢子的形態及產生方式、厚垣孢子的有無及著生方式進行形態鑒定；(4)分子生物學鑒定在形態學特征鑒定的基礎上對分離菌株的rDNA-ITS區域和TEF-1α序列進行擴增；擴增產物回收純化，連接到載體中并轉化大腸桿菌，陽性克隆送交測序，使用DNAMAN軟件對測序結果進行剪切分析，剪切后在線比對分析；其中，rDNA-ITS又稱為核糖體基因內轉錄間隔區域，TEF-1α又稱為翻譯延長因子1α基因；(5)進化樹的構建將獲得的ITS序列和TEF-1α的序列分別與GenBank數據庫和鑒定鐮刀菌的數據庫FUSARIUM-ID中的鐮刀菌的rDNA-ITS和TEF-1α序列進行比較，利用MEGA5軟件進行聚類分析，構建系統發育樹；(6)致病性鑒定于器皿中放置大小均勻的燕麥種子，加水浸泡過夜，除去多余水分，高壓滅菌；器皿中加入接種菌株的瓊脂塊；直至燕麥種子完全接種鐮刀菌后備用；選擇飽滿健康的苜蓿種子，消毒后置于培養皿中催芽，播于盆中培養成植株；待植株培養一段時間后，將提前準備好的燕麥接種于植株；不接種的植株作為對照；接種后培養一段時間，觀察病害情況；根據病斑占根系面積的百分比進行病害分級；統計發病率DI和病害嚴重指數DSI；DI＝(病株數/總株數)×100％；DSI％＝∑(各級病株數×該級代表值)/(調查總株數×最重級別代表值)×100％；切取感病根組織，消毒后接種于PSA平板上進行分離和純化，并采用上述形態學觀察和分子鑒定的方法與最初的接種物進行比較和鑒定。本專利技術所述的紫花苜蓿鐮刀菌根腐病病原菌分離純化與致病性鑒定方法，步驟(2)中所述的切取的小塊組織大小為5×5mm；所述處理的方法為75％的酒精處理30s，0.1％的升汞處理3min，無菌水沖洗3-5次；所述純化到種的方法為PSA培養基上，25℃暗培養4d，挑取菌絲于PSA培養基上純化3次，再經過MGA培養基純化3次后通過在水瓊脂平板上單孢梯度稀釋分離法進一步純化到種；所述分離純化后的鐮刀菌接種的培養基為PSA的試管斜面培養基；所述保存方法為4℃保存，每6個月轉管一次。本專利技術所述的紫花苜蓿鐮刀菌根腐病病原菌分離純化與致病性鑒定方法，步驟(3)中所述的菌種培養方法為25℃培養4d。本專利技術所述的紫花苜蓿鐮刀菌根腐病病原菌分離純化與致病性鑒定方法，步驟(4)中所述的擴增方法為取PSA培養基培養10d的氣生菌絲，提取基因組DNA，ITS區域采用引物ITSl和ITS4進行PCR擴增；TEF-1α序列采用引物ef1和ef2進行擴增；所述引物ITSl、ITS4、ef1和ef2如序列表中SEQIDNO:1-4所示；ITSl：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；ef1：5’-ATGGGTAAGGAGGACAAG-AC-3’；ef2：5’-GGAAGTACCAGTGATCATGTT-3’。本專利技術所述的紫花苜蓿鐮刀菌根腐病病原菌分離純化與致病性鑒定方法，步驟(4)中所述的載體為pEASY-T1載體；所述的大腸桿菌為大腸桿菌DH5α。本專利技術所述的紫花苜蓿鐮刀菌根腐病病原菌分離純化與致病性鑒定方法，步驟(6)中所述的器皿為錐形瓶，其數量為6個；所述的燕麥種子數量為200粒；所述的高壓滅菌次數為2次；所述的瓊脂塊的直徑為1cm，數量為每瓶放入4個；所述的燕麥種子完全接種鐮刀菌的時間為3周；所述的苜蓿種子消毒方法為75％的酒精消毒10min，滅菌水洗5次；所述的催芽時間為1天；所述的播于盆中培養成植株的方法為播于直徑15cm、高度13cm的盆中，營養土：蛭石：石英砂體積比為3:1:1，每盆15株，培養箱中培養，培養條件為25℃光照/20℃黑暗，相對濕度80％；待出苗10天后，每盆定苗10株，3個重復，每個重復30株；所述的植株培養時間為40天；所述的燕麥接種位置為植株地下1cm根頸處，接種數量為每株接種2粒；所述的接種后培養時間為85天；所述的病害分級標準為：0級，無癥狀；1級，根部輕度變色，根部壞死面積在1-30％；2級，根部嚴重變黑褐色，壞死面積在30-60％；3級，主根基本壞死，側根較少，壞死面積60-100％；所述的切取感病根組織的大小為5mm×3mm；所述的感病根組織的消毒方法為70％乙醇消毒1min，無菌水漂洗3次本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種紫花苜蓿鐮刀菌根腐病病原菌分離純化與致病性鑒定方法，其特征在于：包括以下步驟：(1)苜蓿病株的采集與準備對苜蓿田進行定點調查，觀察根腐病的田間癥狀，采集具有典型癥狀的鐮刀菌根腐病病株標樣；(2)病原菌的分離純化于病株標樣的病斑處切取小塊組織，經處理后，純化到種，再將分離純化后的鐮刀菌接到培養基中保存，用于后續的菌種鑒定；(3)病原菌形態學觀察菌種培養一段時間后，依據培養基上的培養性狀，包括菌落形態、色澤、菌落生長速度；通過VBC和SNA限定營養缺乏培養基上對大小分生孢子的有無、分生孢子的形態及產生方式、厚垣孢子的有無及著生方式進行形態鑒定；(4)分子生物學鑒定在形態學特征鑒定的基礎上對分離菌株的rDNA?ITS區域和TEF?1α序列進行擴增；擴增產物回收純化，連接到載體中并轉化大腸桿菌，陽性克隆送交測序，使用DNAMAN軟件對測序結果進行剪切分析，剪切后在線比對分析；其中，rDNA?ITS又稱為核糖體基因內轉錄間隔區域，TEF?1α又稱為翻譯延長因子1α基因；(5)進化樹的構建將獲得的ITS序列和TEF?1α的序列分別與GenBank數據庫和鑒定鐮刀菌的數據庫FUSARIUM?ID中的鐮刀菌的rDNA?ITS和TEF?1α序列進行比較，利用MEGA?5軟件進行聚類分析，構建系統發育樹；(6)致病性鑒定于器皿中放置大小均勻的燕麥種子，加水浸泡過夜，除去多余水分，高壓滅菌；器皿中加入接種菌株的瓊脂塊；直至燕麥種子完全接種鐮刀菌后備用；選擇飽滿健康的苜蓿種子，消毒后置于培養皿中催芽，播于盆中培養成植株；待植株培養一段時間后，將提前準備好的燕麥接種于植株；不接種的植株作為對照；接種后培養一段時間，觀察病害情況；根據病斑占根系面積的百分比進行病害分級；統計發病率DI和病害嚴重指數DSI；DI＝(病株數/總株數)×100％；DSI％＝∑(各級病株數×該級代表值)/(調查總株數×最重級別代表值)×100％；切取感病根組織，消毒后接種于PSA平板上進行分離和純化，并采用上述形態學觀察和分子鑒定的方法與最初的接種物進行比較和鑒定。...

【技術特征摘要】
1.一種紫花苜蓿鐮刀菌根腐病病原菌分離純化與致病性鑒定方法，其特征在于：包括以下步驟：(1)苜蓿病株的采集與準備對苜蓿田進行定點調查，觀察根腐病的田間癥狀，采集具有典型癥狀的鐮刀菌根腐病病株標樣；(2)病原菌的分離純化于病株標樣的病斑處切取小塊組織，經處理后，純化到種，再將分離純化后的鐮刀菌接到培養基中保存，用于后續的菌種鑒定；(3)病原菌形態學觀察菌種培養一段時間后，依據培養基上的培養性狀，包括菌落形態、色澤、菌落生長速度；通過VBC和SNA限定營養缺乏培養基上對大小分生孢子的有無、分生孢子的形態及產生方式、厚垣孢子的有無及著生方式進行形態鑒定；(4)分子生物學鑒定在形態學特征鑒定的基礎上對分離菌株的rDNA-ITS區域和TEF-1α序列進行擴增；擴增產物回收純化，連接到載體中并轉化大腸桿菌，陽性克隆送交測序，使用DNAMAN軟件對測序結果進行剪切分析，剪切后在線比對分析；其中，rDNA-ITS又稱為核糖體基因內轉錄間隔區域，TEF-1α又稱為翻譯延長因子1α基因；(5)進化樹的構建將獲得的ITS序列和TEF-1α的序列分別與GenBank數據庫和鑒定鐮刀菌的數據庫FUSARIUM-ID中的鐮刀菌的rDNA-ITS和TEF-1α序列進行比較，利用MEGA5軟件進行聚類分析，構建系統發育樹；(6)致病性鑒定于器皿中放置大小均勻的燕麥種子，加水浸泡過夜，除去多余水分，高壓滅菌；器皿中加入接種菌株的瓊脂塊；直至燕麥種子完全接種鐮刀菌后備用；選擇飽滿健康的苜蓿種子，消毒后置于培養皿中催芽，播于盆中培養成植株；待植株培養一段時間后，將提前準備好的燕麥接種于植株；不接種的植株作為對照；接種后培養一段時間，觀察病害情況；根據病斑占根系面積的百分比進行病害分級；統計發病率DI和病害嚴重指數DSI；DI＝(病株數/總株數)×100％；DSI％＝∑(各級病株數×該級代表值)/(調查總株數×最重級別代表值)×100％；切取感病根組織，消毒后接種于PSA平板上進行分離和純化，并采用上述形態學觀察和分子鑒定的方法與最初的接種物進行比較和鑒定。2.根據權利要求1所述的紫花苜蓿鐮刀菌根腐病病原菌分離純化與致病性鑒定方法，其特征在于：步驟(2)中所述的切取的小塊組織大小為5×5mm；所述處理的方法為75％的酒精處理30s，0.1％的升汞處理3min，無菌水沖洗3-5次；所述純化到種的方法為PSA培養基上，25℃暗培養4d，挑取菌絲于PSA培養基上純化3次，再經過MGA培養基純化3次后...

【專利技術屬性】
技術研發人員：叢麗麗，康俊梅，張鐵軍，龍瑞才，楊青川，
申請(專利權)人：中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，
類型：發明
國別省市：北京;11