一株牛睪丸傳代細(xì)胞株的建立及其應(yīng)用制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及一株牛睪丸傳代細(xì)胞株的建立及其應(yīng)用。該方法包括：(1)利用新鮮牛睪丸制備原代細(xì)胞并建立牛睪丸細(xì)胞系ZJS?1株；(2)采用單層細(xì)胞法培養(yǎng)牛睪丸傳代細(xì)胞生產(chǎn)豬瘟活疫苗；(3)采用懸浮細(xì)胞法培養(yǎng)牛睪丸細(xì)胞生產(chǎn)豬瘟活疫苗。本發(fā)明專利技術(shù)建立的牛睪丸細(xì)胞系用于豬瘟活疫苗生產(chǎn)具有生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單且穩(wěn)定、易操作，病毒含量高，批間差異小，質(zhì)量易控，可顯著提高疫苗產(chǎn)量和質(zhì)量。利用本發(fā)明專利技術(shù)生產(chǎn)的豬瘟活疫苗安全性好、免疫效力高，對(duì)豬瘟強(qiáng)毒攻擊具有完全的免疫保護(hù)作用。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及一株牛睪丸傳代細(xì)胞株的建立及其應(yīng)用，屬于獸用生物制品領(lǐng)域。
技術(shù)介紹
我國(guó)目前生產(chǎn)豬瘟兔化弱毒疫苗所用的細(xì)胞為牛睪丸原代細(xì)胞和豬腎細(xì)胞。為了改進(jìn)豬瘟病毒的培養(yǎng)工藝，特自主研發(fā)建立牛睪丸傳代細(xì)胞株，又稱牛睪丸細(xì)胞系，在此基礎(chǔ)上建立基礎(chǔ)種子批和生產(chǎn)種子批，并對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)檢定。豬瘟活疫苗為我國(guó)自主研發(fā)的安全及效力均優(yōu)良的活疫苗，在世界范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用，用于預(yù)防豬瘟病毒的感染。原生產(chǎn)用細(xì)胞為牛睪丸原代細(xì)胞，需采集新鮮牛睪丸進(jìn)行制備，近年來隨著牛病疫情的日趨復(fù)雜，采集新鮮牛睪丸制備生產(chǎn)用細(xì)胞存在外源病毒、細(xì)菌及支原體污染的風(fēng)險(xiǎn)，豬腎細(xì)胞作為生產(chǎn)用細(xì)胞是在牛睪丸原代細(xì)胞基礎(chǔ)上的一個(gè)進(jìn)步，作為豬源細(xì)胞，豬源的其他病毒也更容易適應(yīng)該細(xì)胞，并在細(xì)胞上增殖，導(dǎo)致豬源病毒污染。這些外源因子的污染對(duì)活疫苗的安全性和效力構(gòu)成嚴(yán)重威脅，對(duì)使用動(dòng)物及環(huán)境可能造成巨大的損失。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于改進(jìn)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足之處，提供一種用牛睪丸傳代細(xì)胞生產(chǎn)豬瘟活疫苗的方法。該方法具有生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單且穩(wěn)定、易操作，病毒含量高，批間差異小，質(zhì)量易控，可顯著提高疫苗產(chǎn)量和質(zhì)量，在轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞生產(chǎn)線和懸浮細(xì)胞生產(chǎn)線均可進(jìn)行生產(chǎn)。利用本專利技術(shù)生產(chǎn)的豬瘟活疫苗安全性好、免疫效力高，對(duì)豬瘟強(qiáng)毒攻擊具有完全的免疫保護(hù)作用。本專利技術(shù)的技術(shù)方案1.一株牛睪丸傳代細(xì)胞株的建立，其特征在于該細(xì)胞系源自由新鮮牛睪丸制備的原代細(xì)胞，經(jīng)傳代后獲得一株既適用于轉(zhuǎn)瓶單層細(xì)胞培養(yǎng)，又適用于細(xì)胞懸浮培養(yǎng)工藝，且仍保持了對(duì)豬瘟病毒高度敏感性的牛睪丸傳代細(xì)胞株，該株傳代細(xì)胞株被命名為牛睪丸細(xì)胞系(Bovinetestiscellline)ZJS-1株，已于2016年8月23日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為CGMCCNo.12699。2.權(quán)利要求1所述一株牛睪丸傳代細(xì)胞株的應(yīng)用，其特征在于該株牛睪丸細(xì)胞采用單層細(xì)胞培養(yǎng)法和豬瘟病毒兔化弱毒株(AVCCNo.AV1412)用于豬瘟活疫苗的制備3.如權(quán)利要求2所述一株牛睪丸傳代細(xì)胞系的應(yīng)用，其特征在于該株牛睪丸細(xì)胞采用細(xì)胞懸浮培養(yǎng)法和豬瘟病毒兔化弱毒株(AVCCNo.AV1412)用于豬瘟活疫苗的制備。4.如權(quán)利要求2、3所述一株牛睪丸傳代細(xì)胞株的應(yīng)用，其特征在于其中的豬瘟病毒兔化弱毒株(AVCCNo.AV1412)是豬瘟病毒的脾淋毒接種良好單層的牛睪丸細(xì)胞或懸浮培養(yǎng)的牛睪丸細(xì)胞，加入3.5％血清維持液后置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞狀態(tài)，4～5日后收獲病毒，按此方法繼續(xù)傳代病毒，取二收、三收細(xì)胞培養(yǎng)毒液作為生產(chǎn)用毒種。本專利技術(shù)具體實(shí)施方式1.牛睪丸傳代細(xì)胞系的建立選取新出生健康犢牛，手術(shù)摘取睪丸，用Hanks液處理后加入0.25％胰酶溶液消化，棄去胰酶溶液，用玻璃珠振搖法分散細(xì)胞，靜置培養(yǎng)成單層。將長(zhǎng)成單層的牛睪丸細(xì)胞用0.25％胰酶分散并傳代，傳代至F50獲得一株既適用于轉(zhuǎn)瓶單層細(xì)胞培養(yǎng)，又適用細(xì)胞于懸浮培養(yǎng)工藝，且仍保持了對(duì)豬瘟病毒的高度敏感性的牛睪丸傳代細(xì)胞株，該株傳代細(xì)胞被命名為牛睪丸細(xì)胞系(Bovinetestiscellline)ZJS-1株，已于2016年08月23日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為CGMCCNo.12699。2.牛睪丸細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)工藝的建立(1)單層細(xì)胞制備取出凍存的牛睪丸傳代細(xì)胞P11代，置37℃水浴中解凍，1000r/min離心15min，棄掉上清，用含8％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸接種110cm2培養(yǎng)瓶，置37℃、含5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞長(zhǎng)成致密單層，用0.25％胰酶/EDTA消化，按1:3～1:5傳代，擴(kuò)大培養(yǎng)。將擴(kuò)大培養(yǎng)的牛睪丸傳代細(xì)胞接種到3000ml細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶中，置37℃培養(yǎng)至細(xì)胞長(zhǎng)成致密單層。控制轉(zhuǎn)速為8～12r/h。(2)生物反應(yīng)器培養(yǎng)條件實(shí)驗(yàn)室微載體懸浮培養(yǎng)牛睪丸傳代細(xì)胞的條件確定為溫度37℃，pH值7.2，溶氧50％，微載體濃度5g/L、攪拌轉(zhuǎn)速40～45r/min(2L生物反應(yīng)器)、45～50r/min(10L生物反應(yīng)器)、細(xì)胞接種密度1.5×105個(gè)/mg～2.0×105個(gè)/mg。3.豬瘟細(xì)胞活疫苗的制備(1)細(xì)胞毒種的繁殖將豬瘟病毒兔化弱毒株(C株)脾淋毒接種良好單層的牛睪丸傳代細(xì)胞或懸浮培養(yǎng)傳代細(xì)胞，加3.5％血清維持液，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞狀態(tài)，4～5日后收獲病毒，按此方法繼續(xù)傳代病毒，取二收、三收細(xì)胞培養(yǎng)毒液作為生產(chǎn)用毒種；細(xì)胞毒種鑒定：細(xì)胞毒種鑒定完全符合豬瘟兔化弱毒株毒種標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)豬安全無副作用，細(xì)胞毒種每1ml含病毒≥500,000個(gè)家兔感染量。(2)接種單層細(xì)胞制備豬瘟活疫苗取已形成良好單層的上述牛睪丸傳代細(xì)胞培養(yǎng)瓶，棄去細(xì)胞生長(zhǎng)液，接種含豬瘟病毒兔化弱毒株脾淋毒的細(xì)胞維持液，繼續(xù)培養(yǎng)；接毒后第5日作第一次收獲換液，以后每隔5日收獲換液1次，收獲的毒液置-20℃以下保存；將檢驗(yàn)合格的病毒培養(yǎng)液，混合于同一容器內(nèi)，加入穩(wěn)定劑，同時(shí)加入抗生素，充分搖勻，定量分裝；每頭份含細(xì)胞毒液不少于0.015ml，分裝后迅速進(jìn)行冷凍真空干燥后即得成品。(3)按懸浮培養(yǎng)工藝制備豬瘟活疫苗取已形成良好單層的牛睪丸傳代細(xì)胞，用0.25％胰酶/EDTA消化成單個(gè)細(xì)胞并計(jì)數(shù)。根據(jù)生物反應(yīng)器培養(yǎng)體積，每升體積含微載體5g，按1.5×105～2.0×105個(gè)/mg細(xì)胞密度接入細(xì)胞后，加入含6％～8％新生牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，在37℃、30～60r/min、pH值7.2、溶氧50％的條件下培養(yǎng)，每日取樣進(jìn)行細(xì)胞觀察及消化計(jì)數(shù)。當(dāng)一級(jí)生物反應(yīng)器中微載體細(xì)胞計(jì)數(shù)不低于4.0×106個(gè)/ml時(shí)，停止攪拌，待微載體細(xì)胞完全沉淀后，棄去生長(zhǎng)液，將生長(zhǎng)良好的BT細(xì)胞微載體經(jīng)收料管收集至細(xì)胞消化瓶中，用PBS(0.01mol/L，pH值7.2)清洗2次，用0.25％胰酶/EDTA消化后取樣計(jì)數(shù)。根據(jù)二級(jí)生物反應(yīng)器培養(yǎng)體積，按1.5×105～2.0×105個(gè)/mg細(xì)胞密度接入二級(jí)生物反應(yīng)器進(jìn)行放大培養(yǎng)，當(dāng)二級(jí)生物反應(yīng)器中微載體細(xì)胞計(jì)數(shù)不低于3.0×106個(gè)/ml時(shí)，棄去生長(zhǎng)液，加入含1％～3.5％新生牛血清或馬血清的DMEM細(xì)胞維持液，以MOI為0.1～0.5接種生產(chǎn)毒種后，在37℃、30～60r/min、pH值7.2、溶氧50％的條件下培養(yǎng)，接毒后5日做第一次收獲換液(停止攪拌，沉淀，收獲上清液，再加入含1％～3.5％新生牛血清或馬血清的DMEM細(xì)胞維持液)，以后每隔4日收獲換液一次，收獲次數(shù)不超過8次。置-15℃以下保存，不超過6個(gè)月。將檢驗(yàn)合格的病毒培養(yǎng)液，混合于同一容器內(nèi)，加入穩(wěn)定劑，同時(shí)加入抗生素，充分搖勻，定量分裝；每頭份含細(xì)胞毒液不少于0.015ml，分裝后迅速進(jìn)行冷凍真空干燥后即得成品成品檢驗(yàn)：按《中國(guó)獸藥典》(中國(guó)獸藥典委員會(huì).中國(guó)華人民共和國(guó)獸藥典2005年版三部.中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2006，本專利技術(shù)以下稱《中國(guó)獸藥典》)進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)符合“豬瘟活疫苗(細(xì)胞源)”規(guī)定的指標(biāo)，對(duì)豬安全無副作用。每頭份疫苗含病毒≥7500個(gè)家兔感染量。上述技術(shù)方案中，所述含豬瘟本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一株牛睪丸傳代細(xì)胞株的建立，其特征在于該細(xì)胞系源自由新鮮牛睪丸制備的原代細(xì)胞，經(jīng)傳代后獲得一株既適用于轉(zhuǎn)瓶單層細(xì)胞培養(yǎng)，又適用于細(xì)胞懸浮培養(yǎng)工藝，且仍保持了對(duì)豬瘟病毒高度敏感性的牛睪丸傳代細(xì)胞株，該株傳代細(xì)胞株被命名為牛睪丸細(xì)胞系(Bovine?testis?cell?line)ZJS?1株，已于2016年8月23日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為CGMCC?No.12699。

【技術(shù)特征摘要】
1.一株牛睪丸傳代細(xì)胞株的建立，其特征在于該細(xì)胞系源自由新鮮牛睪丸制備的原代細(xì)胞，經(jīng)傳代后獲得一株既適用于轉(zhuǎn)瓶單層細(xì)胞培養(yǎng)，又適用于細(xì)胞懸浮培養(yǎng)工藝，且仍保持了對(duì)豬瘟病毒高度敏感性的牛睪丸傳代細(xì)胞株，該株傳代細(xì)胞株被命名為牛睪丸細(xì)胞系(Bovinetestiscellline)ZJS-1株，已于2016年8月23日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為CGMCCNo.12699。2.權(quán)利要求1所述一株牛睪丸傳代細(xì)胞株的應(yīng)用，其特征在于該株牛睪丸細(xì)胞采用單層細(xì)胞培養(yǎng)法和豬...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：薛青紅，馮忠武，馮忠澤，陳光華，印春生，顧進(jìn)華，孫淼，張廣川，支海兵，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：北京;11