用于改變基因產(chǎn)物的表達的CRISPR-CAS系統(tǒng)和方法技術方案

本發(fā)明專利技術提供了用于改變靶基因序列以及相關基因產(chǎn)物的表達的系統(tǒng)、方法和組合物。提供了多種載體和載體系統(tǒng)、以及用于設計和使用此類載體的方法，其中一些載體和載體系統(tǒng)編碼CRISPR復合物的一種或多種組分。還提供了指導CRISPR復合物在真核細胞中形成的方法以及用于利用CRISPR?Cas系統(tǒng)的方法。

【技術實現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術】相關應用和引用參考本申請要求分別于2013年7月2日和10月5日提交的均具有博德參考號BI-2011/008A、標題為“用于改變基因產(chǎn)物的表達的CRISPR-CAS系統(tǒng)和方法(CRISPR-CAS SYSTEMS AND METHODS FOR ALTERING EXPRESSION OF GENE PRODUCTS)”的美國臨時專利申請61/842,322和美國專利申請14/054,414的優(yōu)先權。還要求分別于2012年12月12日、2013年1月2日、2013年3月15日以及2013年6月17日提交的分別具有博德參考號BI-2011/008/WSGR案卷號44063-701.101、BI-2011/008/WSGR案卷號44063-701.102、博德參考號BI-2011/008/VP案卷號44790.02.2003以及BI-2011/008/VP案卷號44790.03.2003、標題均為“用于序列操縱的系統(tǒng)、方法和組合物(SYSTEMS METHODS AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION)”的美國臨時專利申請61/736,527、61/748,427、61/791,409以及61/835,931的優(yōu)先權。參考了美國臨時專利申請61/758,468；61/769,046；61/802,174；61/806,375；61/814,263；61/819,803以及61/828,130，這些臨時專利申請各自的標題為“用于序列操縱的系統(tǒng)、方法以及組合物的工程化以及優(yōu)化”，分別提交于2013年1月30日；2013年2月25；2013年3月15；2013年3月28；2013年4月20；2013年5月6日以及2013年5月28日。還參考了美國臨時專利申請61/835,936、61/836,127、61/836,101、61/836,080以及61/835,973，每個提交于2013年6月17日。前述申請、以及在其中或在它們的審查程序期間引用的所有文獻或(“申請引用文獻”)以及在這些申請引用文獻中引用或參考的所有文獻、以及在本文中引用或參考的所有文獻(“本文引用的文獻”)、在本文中引用的文獻中引用或參考的所有文獻，連同針對在本文中提及或通過引用結合在本文中的任何文獻中的任何產(chǎn)品的任何制造商的說明書、說明、產(chǎn)品規(guī)格、和產(chǎn)品表，特此通過引用并入本文，并且可以在本專利技術的實踐中采用。更具體地說，所有參考的文獻均通過引用并入本文，其程度如同每個單獨的文獻被確切地并單獨地指明通過引用而并入本文。專利
本專利技術總體上涉及用于控制涉及序列靶向的基因表達的系統(tǒng)、方法、和組合物，該序列靶向例如可使用涉及規(guī)律間隔成簇短回文重復序列(CRISPR)及其組分的載體系統(tǒng)的、基因組微擾或基因編輯。關于聯(lián)邦資助研究的聲明本專利技術是在美國國立衛(wèi)生研究院頒發(fā)的NIH先鋒獎(Pioneer Award)DP1MH100706的政府支持下完成的。美國政府享有本專利技術的某些權利。專利技術背景在基因組測序技術和分析方法中的最新進展顯著加速了對與范圍廣泛的生物功能和疾病相關聯(lián)的遺傳因子進行編目和映射的能力。精確的基因組靶向技術對于通過允許個體遺傳元件的選擇性干擾而使得因果性遺傳變異的統(tǒng)性逆向工程成為可能、以及推進合成生物學、生物技術應用、和醫(yī)學應用是需要的。雖然基因組編輯技術，如設計師鋅指、轉錄激活子樣效應因子(TALE)、或歸巢大范圍核酸酶(homing meganuclease)對于產(chǎn)生靶向的基因組干擾是可得的，但是仍然需要負擔得起的、易于建立的、可擴展的、并且便于靶向真核基因組內(nèi)的多個位置的新的基因組工程技術。專利技術概述對于具有一系列廣泛應用的序列靶向的替代性且穩(wěn)健的系統(tǒng)和技術存在著迫切需要。本專利技術著手解決這種需要并且提供了相關優(yōu)點。CRISPR/Cas或CRISPR-Cas系統(tǒng)(兩個術語在本申請通篇可互換地使用)不要求產(chǎn)生靶向特異性序列的定制蛋白，而是通過一個短RNA分子識別一個特異性DNA靶標，可以對單個Cas酶進行程序設計，換句話說可以使用所述短RNA分子將Cas酶募集到一個特異性DNA靶標。將該CRISPR-Cas系統(tǒng)添加到基因組測序技術和分析方法的組庫中可以顯著使該方法論簡化并且提高對與范圍廣泛的生物功能和疾病相關聯(lián)的遺傳因子進行編目和映射的能力。為了有效而無有害作用地利用CRISPR-Cas系統(tǒng)用于基因組編輯，了解這些基因組工程工具的工程化和優(yōu)化方面是至關重要的，這些方面是請求保護的本專利技術的方面。在一個方面，本專利技術提供了一種改變或修飾一種或多種基因產(chǎn)物的表達的方法，該方法可以包括向包含并表達編碼該一種或多種基因產(chǎn)物的DNA分子的細胞中引入一種工程化的非天然存在的CRISPR-Cas系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以包括一種Cas蛋白和一種或多種指導RNA，該一種或多種指導RNA靶向這些DNA分子，由此該一種或多種指導RNA靶向編碼該一種或多種基因產(chǎn)物的DNA分子的基因組座位并且該Cas蛋白切割編碼該一種或多種基因產(chǎn)物的DNA分子的該基因組座位，由此該一種或多種基因產(chǎn)物的表達被改變或修飾；并且，其中該Cas蛋白和該指導RNA并不共同天然存在。本專利技術包括，兩種或更多種基因產(chǎn)物的表達可以被改變或修飾。本專利技術進一步包括，該指導RNA包括一種融合到tracr序列上的指導序列。在一個優(yōu)選實施例中，該細胞是一種真核細胞，在一個更優(yōu)選的實施例中，該細胞是一種哺乳動物細胞并且在一個仍更優(yōu)選的實施例中，該哺乳動物細胞是一種人類細胞。本專利技術還包括，該Cas蛋白可以包括一個或多個核定位信號(NLS)。在一些實施例中，該Cas蛋白是一種II型CRISPR系統(tǒng)酶。在一些實施例中，該Cas蛋白是一種Cas9蛋白。在一些實施例中，該Cas9蛋白是肺炎鏈球菌、化膿鏈球菌或嗜熱鏈球菌Cas9，并且可包括源自于這些生物的突變的Cas9。該蛋白可以是一種Cas9同系物或直向同源物。在一些實施例中，該Cas蛋白是密碼子優(yōu)化的，用于在真核細胞中進行表達。在一些實施例中，該Cas蛋白指導切割在該靶序列位置處的一條或兩條鏈。在本專利技術的一個另外的方面，該基因產(chǎn)物的表達被降低并且該基因產(chǎn)物是一種蛋白質。本專利技術包括，引入細胞中是經(jīng)由一種遞送系統(tǒng)該遞送系統(tǒng)可以包括病毒粒子、脂質體、電穿孔、顯微注射或綴合。在另一個方面，本專利技術提供了一種改變或修飾一種或多種基因產(chǎn)物的表達的方法，該方法包括向包含并表達編碼該一種或多種基因產(chǎn)物的DNA分子的細胞中引入一種工程化的非天然存在的載體系統(tǒng)，該載體系統(tǒng)可以包括一種或多種載體，該一種或多種載體包括：a)一種第一調(diào)節(jié)元件，該第一調(diào)節(jié)元件可操作地連接到一種或多種與編碼該一種或多種基因產(chǎn)物的DNA分子的基因組座位中的靶序列雜交的CRISPR-Cas系統(tǒng)指導RNA上，b)一種第二調(diào)節(jié)元件，該第二調(diào)節(jié)元件可操作地連接到一種Cas蛋白上，其中組分(a)和(b)位于該系統(tǒng)的相同或不同載體上，由此這些指導RNA靶向編碼該一種或多種基因產(chǎn)物的DNA分子的基因組座位并且該Cas蛋白切割編碼該一種或多種基因產(chǎn)物的DNA分子的該基因組座位，由此該一種或多種基因產(chǎn)物的表達被改變或修飾；并且，其中本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術保護點】
一種改變一種或多種基因產(chǎn)物的表達的方法，該方法包括向包含并表達編碼該一種或多種基因產(chǎn)物的DNA分子的細胞中引入一種工程化的非天然存在的CRISPR?Cas系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括一種Cas蛋白和一種或多種指導RNA，該一種或多種指導RNA靶向這些DNA分子，由此該一種或多種指導RNA靶向編碼該一種或多種基因產(chǎn)物的DNA分子的基因組座位并且該Cas蛋白切割編碼該一種或多種基因產(chǎn)物的DNA分子的基因組座位，由此該一種或多種基因產(chǎn)物的表達被改變；并且，其中該Cas蛋白和該指導RNA并不共同天然存在。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2012.12.12 US 61/736527;2013.01.02 US 61/748427;201.一種改變一種或多種基因產(chǎn)物的表達的方法，該方法包括向包含并表達編碼該一種或多種基因產(chǎn)物的DNA分子的細胞中引入一種工程化的非天然存在的CRISPR-Cas系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括一種Cas蛋白和一種或多種指導RNA，該一種或多種指導RNA靶向這些DNA分子，由此該一種或多種指導RNA靶向編碼該一種或多種基因產(chǎn)物的DNA分子的基因組座位并且該Cas蛋白切割編碼該一種或多種基因產(chǎn)物的DNA分子的基因組座位，由此該一種或多種基因產(chǎn)物的表達被改變；并且，其中該Cas蛋白和該指導RNA并不共同天然存在。2.一種改變一種或多種基因產(chǎn)物的表達的方法，該方法包括向包含并表達編碼該一種或多種基因產(chǎn)物的DNA分子的細胞中引入一種工程化的非天然存在的載體系統(tǒng)，該載體系統(tǒng)包括一種或多種載體，該一種或多種載體包括：a)一種第一調(diào)節(jié)元件，該第一調(diào)節(jié)元件可操作地連接到一種或多種CRISPR-Cas系統(tǒng)指導RNA上，該一種或多種CRISPR-Cas系統(tǒng)指導RNA與編碼該一種或多種基因產(chǎn)物的DNA分子的基因組座位中的靶序列雜交，b)一種第二調(diào)節(jié)元件，該第二調(diào)節(jié)元件可操作地連接至一種Cas蛋白，其中組分(a)和(b)位于該系統(tǒng)的相同或不同載體上，由此這些指導RNA靶向編碼該一種或多種基因產(chǎn)物的DNA分子的基因組座位并且該Cas蛋白切割編碼該一種或多種基因產(chǎn)物的DNA分子的基因組座位，由此該一種或多種基因產(chǎn)物的表達被改變；并且，其中該Cas蛋白和這些指導RNA并不共同天然存在。3.如權利要求1或權利要求2所述的方法，其中兩種或更多種基因產(chǎn)物的表達被改變。4.如任何以上權利要求所述的方法，其中該系統(tǒng)的載體或Cas蛋白進一步包括一個或多個NLS。5.如任何以上權利要求所述的方法，其中這些指導RNA包括一種融合到tracr序列上的指導序列。6.如任何以上權利要求所述的方法，其中該細胞是一種真核細胞。7.如權利要求6所述的方法，其中該真核細胞是一種哺乳動物細胞。8.如權利要求7所述的方法，其中該哺乳動物細胞是一種人類細胞。9.如任何以上權利要求所述的方法，其中該Cas蛋白是一種Cas9蛋白。10.如任何以上權利要求所述的方法，其中該Cas蛋白是密碼子優(yōu)化的，用于在真核細胞中進行表達。11.如任何以上權利要求所述的方法，其中該基因產(chǎn)物的表達被降低。12.如任何以上權利要求所述的方法，其中該基因產(chǎn)物是一種蛋白質。13.如任...

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：F張，
申請(專利權)人：布羅德研究所有限公司，麻省理工學院，
類型：發(fā)明
國別省市：美國;US