本發明專利技術提供了來自PD?L1蛋白質的具體的肽和這些肽的衍生電離特性，其特別有利于通過選擇反應監測(SRM)質譜或也可稱作多反應監測(MRM)質譜的方法直接定量已經在福爾馬林中固定的生物樣品中的PD?L1蛋白質。這類生物樣品是經化學保藏和固定的，所述生物樣品選自使用含有試劑/固定劑的甲醛處理的組織和細胞，包括福爾馬林固定的組織/細胞、福爾馬林固定/石蠟包埋(FFPE)的組織/細胞、FFPE組織塊和來自那些塊的細胞，以及經福爾馬林固定和或石蠟包埋的組織培養細胞。使用Liquid?TissueTM試劑和方案從所述生物樣品中制備蛋白質樣品并通過在蛋白質樣品中定量至少一種或多種所描述的肽來使用SRM/MRM質譜的方法在Liquid?TissueTM樣品中定量PD?L1蛋白質。這些肽在其以修飾的或未修飾的形式存在時可被定量。PD?L1片段肽的修飾的形式的一個示例是肽序列內酪氨酸、蘇氨酸、絲氨酸和/或其他氨基酸殘基的磷酸化。
【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】引言人們使用一批殺傷正在生長和分裂的細胞并以多種方式發揮功能的治療劑來治療癌癥。常見的化療劑集合已被單獨或聯合使用了數十年，且該常見的試劑集合已成為臨床腫瘤學實踐中傳統且常規的癌癥治療手段。這類傳統的化療劑通過殺傷所有快速分裂的細胞來發揮作用，快速分裂是大多數癌細胞的主要特性之一。然而，這些試劑也殺傷正在生長的正常細胞，因此這些試劑不被視作殺傷癌細胞的“靶向”方法。近年來，已開發出大量僅特異性靶向癌細胞的癌癥治療劑，其中這些治療劑特異性攻擊僅由癌細胞表達而正常細胞不表達的蛋白質。這種方式被視癌癥治療的“靶向”方法。最近，以“靶向”方式殺傷癌細胞的另一種方法是特異性調控免疫系統以增強癌癥患者的免疫系統殺傷癌細胞的能力。已知癌細胞的PD-L1表達增加可使這些細胞規避宿主免疫系統。其中癌細胞表達高水平PD-L1的腎細胞癌與增加的腫瘤侵染性和提高4.5倍的死亡風險相關。此外，與在其癌細胞中具有較低PD-L1表達的卵巢癌患者相比，具有較高PD-L1表達的患者的預后顯著較差。在這些患者中，PD-L1表達與上皮內CD8+T淋巴細胞計數負相關，表明在癌細胞外側上表達的PD-L1可抑制CD8+T細胞的抗腫瘤活性。這鼓勵開發PD-L1抑制劑以壓制癌細胞的細胞表面上PD-L1的存在，其繼而產生更強的CD8+T細胞的癌細胞殺傷活性。基于這一最新癌癥治療方法，重要的是了解癌細胞中的PD-L1表達水平以確定使用PD-L1抑制劑治療特定癌癥是否會對給定患者中免疫介導的癌細胞殺傷產生顯著影響。提供了用于一種或多種SRM/MRM測定的肽和肽序列，這些SRM/MRM測定可用于定量測定直接處于來自癌癥患者的患者來源的生物樣品中的PD-L1蛋白質水平，目的是實現改進的癌癥療法的治療決定。
技術實現思路
提供來源于PD-L1蛋白質的子序列的特異性肽。PD-L1也稱作程序性細胞死亡1配體1，分化群274(CD274)蛋白質和B7同源物1(B7-H1)。PD-L1蛋白質由CD274基因編碼，并且在本專利技術中稱作PD-L1。來源于蛋白質的各種肽的肽序列和碎片/過渡離子可用于基于質譜的選擇性反應監測(SRM)測定中，其也稱為多反應監測(MRM)測定，在下文中稱作SRM/MRM測定。描述了用于PD-L1蛋白質及該蛋白質的同種型的SRM/MRM分析的肽的用途。可使用一種或多種、兩種或更多種、三種或更多種、四種或更多種或五種或更多種SRM/MRM測定來檢測是否存來源于PD-L1蛋白質的切割的一種或多種特異性肽并測量其相對或絕對定量水平，并由此提供通過質譜法測量在從生物樣品中獲得的給定蛋白質制備物中PD-L1蛋白質的總量的方法。可從那些蛋白質中得到的肽中的全部或全部的一部分也可在單一SRM/MRM測定中同時分析或可在單個SRM/MRM測定的任何組合中分析。這些肽各自提供通過質譜對生物樣品中獲得的給定蛋白質制備物中PD-L1蛋白質總量的測量。本文描述的SRM/MRM測定可直接測量由從諸如福爾馬林固定的癌癥患者組織(例如切除的腫瘤或活檢樣品)的患者組織樣品取得的細胞制備的復雜蛋白質裂解物樣品中的那些肽。由福爾馬林固定的組織制備蛋白質樣品的方法描述在美國專利第7,473,532號中，其內容通過引用全文納入本文。該專利描述的方法可使用獲自表達病理學公司(Expression Pathology Inc.)(馬里蘭州羅克維爾)的Liquid試劑和方案方便地進行。對從癌癥患者中手術移出的組織進行甲醛/福爾馬林固定是在病理學實踐中已經接受的常規方法。因此，甲醛/福爾馬林固定的石蠟包埋組織是最廣泛可用的來自那些患者的組織形式。甲醛/福爾馬林固定通常采用稱為福爾馬林的甲醛水溶液。“100％”福爾馬林由甲醛在水中的飽和溶液(約40體積％甲醛或37重量％)組成，其含有少量用于限制氧化和聚合程度的穩定劑，通常為甲醇。保藏組織的最常用方式是將整個組織在通常稱為10％中性緩沖福爾馬林的甲醛水溶液中長時間(8小時至48小時)浸泡，接著在室溫下將固定的整個組織包埋在石蠟中以便長期儲存。因此，分析福爾馬林固定的癌癥組織的分子分析方法將是用于分析癌癥患者組織的最被接受且大量利用的方法。SRM/MRM測定的結果可用于關聯自其中收集并保藏組織(生物樣品)的患者或受試者的具體組織樣品(例如癌癥組織樣品)內這些蛋白質中的任一種或全部的準確且精確的定量水平，以及這些蛋白質的潛在同種型的準確且精確的定量水平。這不僅提供關于癌癥的診斷信息，而且容許醫師或其它醫療專業人員確定用于患者或受試者的適當療法。提供關于在患病組織中或在另一患者/受試者樣品中蛋白質表達水平的診斷和治療重要信息的這一測定稱為伴隨診斷測定。例如，這一測定可設計用于診斷癌癥的階段、程度或組織學并確定將最有效地阻止癌癥細胞生長的治療劑，從而確定患者或受試者將最可能應答的治療劑。更具體而言，對來自患者的癌細胞中的PD-L1蛋白質中的一種或多種、兩種或更多種、三種或更多種、四種或更多種、五種或更多種肽的檢測和/或定量提供了蛋白質信息，其可指示隨后應進行哪種或哪幾種治療方案。專利技術詳述本專利技術所述的測定定量或測量來自PD-L1蛋白質的特定未修飾的肽的相對或絕對水平并且可測量來自PD-L1蛋白質的特定修飾的肽的相對或絕對水平。修飾的示例包括在這些肽上存在的磷酸化氨基酸殘基和糖基化氨基酸殘基。蛋白質及蛋白質同種型的相對定量水平可通過SRM/MRM方法確定，例如通過比較SRM/MRM特征峰面積(signature peak area)(例如，特征峰面積或積分的片段離子強度)來確定。單個PD-L1肽的相對水平可在不同樣品(例如，對照樣品和由患者或受試者的組織制備的樣品)中確定。或者，在各種肽具有其自己的特異性SRM/MRM特征峰的情況下，可以比較PD-L1特征肽中的一種或多種的多個SRM/MRM特征峰面積。通過比較峰面積，可以確定一種生物樣品中或一種或多種額外或不同的生物樣品中PD-L1蛋白質和潛在蛋白質同種型含量的相對水平。以此方式，可通過在相同實驗條件下測定多個(例如，二、三、四、五或更多個)生物樣品來確定來自PD-L1蛋白質的一種或多種特定肽的相對含量并從而確定PD-L1蛋白質及潛在同種型的相對含量。另外，確定單一樣品內來自PD-L1蛋白質的一種或多種給定肽的相對定量的方法可以是通過SRM/MRM方法比較該肽的特征峰面積與同一來自生物樣品的蛋白質制備物中的來自不同的一種或多種蛋白質的其他和不同的一種或多種肽的特征峰面積。使用這類方法，可確定來自PD-L1蛋白質的特定肽的含量，從而確定相應蛋白質及其潛在同種型中的每一種的含量，所述含量是相對于同一樣品內或不同樣品中的一種對于另一種而言的。因為單個肽或多種肽的相對定量可相對于樣品內或樣品之間的另外一種或多種肽的含量來進行，所以可以確定所存在的肽的相對含量(例如，通過確定一種肽相對于另一種肽的峰面積)，而與生物樣品中蛋白質的絕對重量：體積或重量：重量的含量無關。因此，來自生物樣品的蛋白質制備物中一種或多種PD-L1肽的含量可用來確定在多種樣品內及多種樣品之間的PD-L1蛋白質的含量。通常將不同樣品之間單個特征峰面積的相對定量數據標準化至每種樣品的所分析蛋白質的含量(例本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種測量生物樣品中PD?L1蛋白質水平的方法，包括使用質譜檢測和/或定量來自所述生物樣品的蛋白質消化物中一種或多種修飾的和/或未修飾的PD?L1蛋白質片段肽的含量；和計算所述樣品中修飾的或未修飾的PD?L1蛋白質的水平；且其中所述含量是相對含量或絕對含量。
【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2014.01.06 US 61/924,2181.一種測量生物樣品中PD-L1蛋白質水平的方法，包括使用質譜檢測和/或定量來自所述生物樣品的蛋白質消化物中一種或多種修飾的和/或未修飾的PD-L1蛋白質片段肽的含量；和計算所述樣品中修飾的或未修飾的PD-L1蛋白質的水平；且其中所述含量是相對含量或絕對含量。2.權利要求1所述的方法，其進一步包括在檢測和/或定量一種或多種修飾的或未修飾的PD-L1蛋白質片段肽之前對所述蛋白質消化物進行分級的步驟。3.權利要求1所述的方法，其中所述生物樣品的所述蛋白質消化物通過Liquid TissueTM方案制備。4.權利要求1所述的方法，其中所述蛋白質消化物包含蛋白酶消化物。5.權利要求1所述的方法，其中所述質譜包括串聯質譜、離子阱質譜、三重四極質譜、MALDI-TOF質譜、MALDI質譜和/或飛行時間質譜。6.權利要求1-5中任一項所述的方法，其中所述PD-L1蛋白質片段肽包括如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列。7.權利要求1-5中任一項所述的方法，其中所述生物樣品是血液樣品、尿樣品、血清樣品、腹水樣品、疲液樣品、淋巴液、唾液樣品、細胞或實體組織。8.權利要求1-5中任一項所述的方法，其進一步包括定量修飾的和/或未修飾的PD-L1蛋白質片段肽。9.權利要求8所述的方法，其中定量所述PD-L1蛋白質片段肽包括比較一種生物樣品中如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示的包含PD-L1蛋白質的約8至約45個氨基酸殘基的氨基酸序列的一種或多種PD-L1蛋白質片段肽的含量與不同且單獨的生物樣品中相同PD-L1蛋白質片段肽的含量。10...
【專利技術屬性】
技術研發人員：大衛·B·克里茨曼，托德·哈姆布拉夫，史諾·塞帕洛比爾，廖偉莉，恩克楊·安，
申請(專利權)人：愛科譜迅病理研究公司，
類型：發明
國別省市：美國;US
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