一種抑制神經二次損傷的人少突膠質祖細胞的制備方法及其試劑盒與應用技術

本發明專利技術提供一種抑制神經二次損傷的人少突膠質祖細胞的制備方法，其中，所述方法包括構建兩個神經膠質生長因子的病毒表達載體，共轉染人少突膠質祖細胞，可高表達該兩個神經膠質生長因子，即生長相關因子43和神經膠質生長因子2，發揮兩者共同作用促進少突膠質細胞的修復，抑制少突膠質細胞損傷后的增生反應和膠質瘢痕形成，而造成的神經二次損傷；同時也利用了少突膠質祖細胞自身增殖分化能力，參與神經功能的修復，無成瘤性；并提供一種制備該抑制神經二次損傷的人少突膠質祖細胞的試劑盒。本發明專利技術提供的人少突膠質祖細胞將對神經系統疾病有著很好的治療效果。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種抑制神經二次損傷的人少突膠質祖細胞的制備方法以及通過所述方法獲得抑制神經二次損傷的人少突膠質祖細胞，特別地，本專利技術涉及構建含兩個神經膠質生長因子的病毒表達載體，使得人少突膠質祖細胞能穩定表達該兩個神經膠質生長因子，共同發揮兩者生物學功能；并提供一種制備該抑制神經二次損傷的人少突膠質祖細胞的試劑盒。本專利技術提供的人少突膠質祖細胞保持良好的增殖能力，參與神經功能的修復，而無成瘤性，可望用于臨床治療神經系統疾病，促使受損神經細胞的修復。
技術介紹
神經系統疾病在缺血、缺氧和損傷等情況下，造成星形膠質細胞損傷后鈣離子濃度明顯變化，激活細胞內鈣離子信號傳導并參與星形膠質細胞損傷后的增生反應，星形膠質細胞異常增殖造成了膠質瘢痕的形成，阻礙了損傷神經軸突有效再生和生長，主要為中樞神經損傷性疾病，即外傷性腦損傷、腦出血、腦缺血和脊髓損傷等。神經損傷早期星形膠質細胞處于成熟早期，可以分泌細胞因子維持和促進神經元功能發揮，并起到神經組織支架的作用；但其成熟以后，早期具有的多種有益功能逐漸消失，反而分泌有害因子，形成化學性膠質屏障，影響神經再生，阻礙軸突延長。位于損傷界面內成熟的星形膠質細胞顯示有抑制軸突生長的蛋白聚糖表達，并且在瘢痕組織的形成中起主要的作用。膠質細胞過度增生和膠質瘢痕形成，導致機械性障礙，影響軸突的再生、延長和融合，并且可以形成微血管套，壓迫微血管，影響局部的血液供應，這些均對神經細胞造成了二次損傷作用。本專利技術申請人意外發現，成體干細胞分泌的神經膠質生長因子在神經二次損傷抑制中發揮了重要的作用，其可以改善機體微環境，促進干細胞和內源性
的干細胞修復作用，但是干細胞分泌的神經膠質生長因子是非常有限的，有研究認為實際上干細胞移植治療，真正發揮作用的是其分泌的神經膠質生長因子。本專利技術將構建好的含兩個神經膠質生長因子片段，重組到病毒載體上，共轉染人少突膠質祖細胞后表達兩個神經膠質生長因子，共同發揮兩者的生物學功能，而無成瘤性，具有良好的協同效果。人少突膠質祖細胞來源方便，主要包括臍血、胎盤血、骨髓和流產胎腦等，細胞培養獲得簡單，可以做到個體化，也可以使用免疫原性低的異體細胞。因而，本專利技術表達兩個神經膠質生長因子的人少突膠質祖細胞制備簡單，高表達兩個神經膠質生長因子，抑制星形膠質細胞異常增殖和膠質瘢痕形成，共同創造有利于神經再生的微環境，抑制神經的二次損傷，有望對中樞損傷性疾病產生更佳的治療效果。
技術實現思路
近年來干細胞治療神經系統疾病的臨床療效得到廣泛的認可，干細胞移植促進了神經細胞修復及神經再生，改善神經軸突和行為功能恢復。中樞神經損傷性疾病后期因小膠質細胞激活引發了星形膠質細胞成熟和異常增殖，導致膠質瘢痕形成和神經炎癥反應，對神經細胞造成了二次損傷。本專利技術基于我們前期研究工作基礎，利用人少突膠質祖細胞增殖分化和“歸巢”的特性，將構建的兩個神經膠質生長因子基因片段的重組病毒載體進行轉染，可高表達這兩個神經膠質生長因子，協同發揮神經膠質生長因子的生物學作用和少突膠質祖細胞本身的功能，可以填充損傷的界面、抑制膠質瘢痕形成、重新排列受體組織和延遲軸突生長抑制因子蛋白聚糖的表達，抑制神經二次損傷。其中，所述神經膠質生長因子為生長相關因子43(growth-associated protein-43，GAP-43)和神經膠質生長因子2(glial growth factor 2，GGF-2)；GAP-43表達上調促進神經元生長，抑制膠質瘢痕形成；GGF-2表達升高有助于神經功能恢復，并改善神經炎癥反應，控制對神經細胞的損傷作用。兩者協同作用，可以填充損傷的界面、抑制膠質瘢痕形成、重新排列受體組織和延遲
軸突生長抑制因子蛋白聚糖的表達，抑制神經二次損傷。本專利技術經我們研發工作中發現了神經膠質生長因子慢病毒載體轉染的人少突膠質祖細胞(Oligodendrocyte precursor cells，OPCs)，其穩定表達的神經膠質生長因子能抑制神經二次損傷，而且無成瘤活性。這一研究結果提示了我們可以通過該兩個神經膠質生長因子構建慢病毒載體轉染人少突膠質祖細胞，使得人少突膠質祖細胞經多次傳代培養后仍穩定表達該兩個神經膠質生長因子，具有發揮其各自生物學功能的能力。在保證了臨床治療使用的細胞數量的同時，也保持了干細胞很強的增殖、分化、歸巢活性，可能在臨床治療中樞神經損傷疾病中發揮著更佳的作用。本專利技術提供了一種抑制神經二次損傷的人少突膠質祖細胞的制備方法，其特征在于，所述方法包括構建兩個神經膠質生長因子的病毒表達載體上，共轉染人少突膠質祖細胞，制備成可高表達該兩個神經膠質生長因子的少突膠質祖細胞，抑制膠質細胞增生造成神經二次損傷促進神經損傷修復；其中，所述神經膠質生長因子為生長相關因子43(GAP-43)和神經膠質生長因子2(GGF-2)。在通過熒光定量PCR試劑盒按照使用說明書檢測，轉染了重組GAP-43和GGF-2病毒載體的OPCs傳代培養到第10代后，其表達GAP-43和GGF-2基因均高于未轉染的第1代OPCs，分別高于至少45和67倍；脊髓損傷大鼠模型中，GAP43/GGF2病毒共轉染的OPCs移植后28天BBB(Basso Beattie Bresnahan)運動功能評分改善值為20.00±5.00，皮層體感誘發電位CSEP波幅改善值6.00±1.00；所述GAP43/GGF2-OPCs在治療脊髓損傷大鼠中，其抑制星形膠質細胞增殖和膠質瘢痕形成。本專利技術所述人少突膠質祖細胞來源方便，細胞培養獲得簡單，可以從患者骨髓個體化獲得，也可以作為異體規模化生產，能做到個體化應用。人少突膠質祖細胞來源人廢棄臍帶血、胎盤血、自體骨髓和流產胎腦等，優選地，來源于人自體骨髓。本專利技術所述人少突膠質祖細胞制備方法，即從骨髓經淋巴細胞分離液分離純化得到的單個核細胞，用無血清少突膠質細胞培養基(即DMEM/F12(1∶1)含1％N2、2mM L-谷氨酰胺、5-100ng/ml堿性成纖維生長因子、1-50ng/ml成纖維生長因子4，1-100ng/ml干細胞生長因子和1-100ng/ml FMS樣酪氨酸激酶
3配體)在10-200μg/ml多聚賴氨酸包被的75cm2細胞培養瓶中原代和傳代培養，獲得人少突膠質祖細胞；優選地，無血清少突膠質細胞培養基為DMEM/F12(1∶1)含1％N2、2mM L-谷氨酰胺、30ng/ml堿性成纖維生長因子、5ng/ml成纖維生長因子4，10ng/ml干細胞生長因子和5ng/ml FMS樣酪氨酸激酶3配體；使用50μg/ml多聚賴氨酸包被的75cm2細胞培養瓶。人少突膠質祖細胞經流式細胞技術檢測，OPCs標志物A2B5、O4和Sox10均表達95％以上。本專利技術所述的病毒載體，可以在細胞內穩定增殖和表達目的基因，主要為慢病毒、腺病毒、逆轉錄病毒等，優選地，選擇慢病毒表達系統。本專利技術提供一種抑制神經二次損傷的人少突膠質祖細胞的制備方法，其特征在于，將人GAP-43和GGF-2序列通過PCR從正常人外周血基因組DNA中擴增下來，得到了GAP-43和GGF-2目的片段。將該兩個目的DNA片段連接到表達質粒上構建成重組質粒后，經陽性克隆PCR鑒定和本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種抑制神經二次損傷的人少突膠質祖細胞(OPCs)的制備方法，其特征在于，所述方法包括構建兩個神經膠質生長因子的病毒表達載體，包裝成病毒后，共轉染人少突膠質祖細胞，制備成可高表達該兩個神經膠質生長因子的少突膠質祖細胞，其無成瘤活性；其中，所述神經膠質生長因子為生長相關因子43(GAP?43)和神經膠質生長因子2(GGF?2)；在通過熒光定量PCR試劑盒按照使用說明書檢測，轉染了重組GAP?43和GGF?2病毒載體的OPCs傳代培養到第10代后，其表達GAP?43和GGF?2基因均高于未轉染的第1代OPCs，至少分別高45倍和67倍；脊髓損傷大鼠模型中，GAP43/GGF2病毒共轉染的OPCs移植后28天BBB(Basso?Beattie?Bresnahan)運動功能評分改善值為20.00±5.00，皮層體感誘發電位CSEP波幅改善值6.00±1.00；所述GAP43/GGF2?OPCs在治療脊髓損傷大鼠中，其抑制星形膠質細胞增殖和膠質瘢痕形成。

【技術特征摘要】
1.一種抑制神經二次損傷的人少突膠質祖細胞(OPCs)的制備方法，其特征在于，所述方法包括構建兩個神經膠質生長因子的病毒表達載體，包裝成病毒后，共轉染人少突膠質祖細胞，制備成可高表達該兩個神經膠質生長因子的少突膠質祖細胞，其無成瘤活性；其中，所述神經膠質生長因子為生長相關因子43(GAP-43)和神經膠質生長因子2(GGF-2)；在通過熒光定量PCR試劑盒按照使用說明書檢測，轉染了重組GAP-43和GGF-2病毒載體的OPCs傳代培養到第10代后，其表達GAP-43和GGF-2基因均高于未轉染的第1代OPCs，至少分別高45倍和67倍；脊髓損傷大鼠模型中，GAP43/GGF2病毒共轉染的OPCs移植后28天BBB(Basso Beattie Bresnahan)運動功能評分改善值為20.00±5.00，皮層體感誘發電位CSEP波幅改善值6.00±1.00；所述GAP43/GGF2-OPCs在治療脊髓損傷大鼠中，其抑制星形膠質細胞增殖和膠質瘢痕形成。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，通過聚合酶鏈式反應(PCR)技術擴增生長相關因子43和神經膠質生長因子2cDNA序列，分別重組到表達質粒上，經酶切位點連接到病毒表達載體上，兩個基因重組病毒載體共轉染人少突膠質祖細胞，獲得增殖能力增強和分化能力的人少突膠質祖細胞。3.根據權利要求1-2任一項所述的方法，其特征在于，所述少突膠質祖細胞來源人廢棄臍帶血、胎盤血、臍帶或自體骨髓體外培養獲得的，優選地，來源于人自體骨髓。4.根據權利要求1-3任一項所述的方法，其特征在于，所述少突膠質祖細胞制備方法如下：取從20ml骨髓經淋巴細胞分離液分離純化得到的單個核細胞，用無血清少突膠質細胞培養基重懸到2-5×106/ml，吸取10ml加入到10-200μg/ml多聚賴氨酸包被的75cm2細胞培養瓶中，于37℃、5％CO2細胞培養箱中培養48小時；更換新鮮含細胞因子的無血清少突細胞培養基再連續培養，直到細胞生長融合達到90％，使用質量體積比為0.25％是胰酶進行消化，進行傳代培養，即1瓶傳代2瓶，補充新鮮含細胞因子的無血清少突細胞培養基繼續培養，獲
\t得人少突膠質祖細胞；其中，所述細胞培養基優選為DMEM/F12，其含1％N2、2mM L-谷氨酰胺、5-100ng/ml堿性成纖維生長因子、1-50ng/ml成纖維生長因子4、1-100ng/ml干細胞生長因子和1-100ng/ml FMS樣酪氨酸激酶3配體；所述胰酶優選含質量體積比為0.02％的EDTA；人少突膠質祖細胞經流式細胞技術檢測，OPCs標志物A285、O4和Sox10均表達95％以上。5.一種抑制神經二次損傷的人少突膠質祖細胞的制備方法，其特征在于，將人GAP-43和GGF-2序列通過PCR從正常人外周血基因組DNA中擴增下來，將GAP-43和GGF-2目的片段分別和XhoI/Nde I雙酶切的pET28a載體片段，在T4DNA連接酶作用下，于4℃、12小時連接反應制備克隆連接液，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5a后進行陽性克隆PCR鑒定和測序鑒定；PCR產物凝膠電泳檢測和測序鑒定符合GAP-43和GGF-2大小和序列后，將測序正確的菌液轉接于10ml含相應抗生素的LB液體培養基中，37℃培養過夜，用無內毒素質粒小提中量試劑盒進行質粒抽提，抽提合格的重組質粒放置-80℃超低溫冰箱中長期保存；所述GAP-43和GGF-2基因片段大小分別為706bp和1268bp；分別將GAP-43、GGF-2DNA片段和GV358載體進行XhoI/Nde I雙酶切，在T4DNA連接酶作用下，將GAP-43片段和酶切GV358載體以及GGF-2片段和酶切GV358載體分別于37℃、12小時連接反應制備克隆連接液，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5a后，進行陽性克隆PCR鑒定和測序鑒定；取細胞狀態良好，處于對數生長期的293T細胞，細胞計數后，按照每個10cm的培養皿6×106個細胞數接種于培養皿中，37℃，5％CO2的培養箱中培養過夜；第二天轉染前移去培養液，換5ml Opti-MEM培養液；取9μg包裝混合液和3μg慢病毒表達質粒加入1.5ml Opti-MEM中，輕輕混勻，取36μl lipofectamine2000加入1.5ml Opti-MEM中，輕輕混勻，室溫放置5min；混合質粒溶液和lipofectamine 2000稀釋液，置室溫20min；混合液緩慢滴加至293T細胞的培養液中，混勻，于37℃、5％CO2細胞培養箱中培養；培養6h后棄去含有轉染混和物的培養基，加入10ml的PBS液清洗一次，輕柔晃動培養皿以洗滌殘余的轉染混和物后倒棄；緩慢加入含10％血清的細胞培養基20ml，于37℃、含5％CO2
\t培養箱內繼續培養48-72h；根據細胞狀態，收集轉染后48h的293T細胞上清液；于4℃，4000g離心10min，除去細胞碎片；以0.45μm濾器過濾上清液于40ml超速離心管中；分別配平樣品，將帶有病毒上清液的超速離心管逐一放入至Beckman超速離心機內，設置離心參數...

【專利技術屬性】
技術研發人員：李一民，李一漢，陳宗明，
申請(專利權)人：北京希普生國際生物醫學研究院，
類型：發明
國別省市：北京;11