一種篩選α–淀粉酶抑制劑的方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種篩選α-淀粉酶抑制劑的方法，所述方法包括：配制酶促反應(yīng)緩沖液、底物溶液、α-淀粉酶溶液、顯色劑溶液和供試品溶液，備用；將供試品溶液點(diǎn)樣于薄層板上，揮去溶劑后或使用適宜的展開劑展開晾干后浸漬于底物溶液中，然后取出、揮干溶劑，再浸漬于α-淀粉酶溶液中，在5～50℃進(jìn)行酶促反應(yīng)10～60分鐘；反應(yīng)完成后，取出薄層板、揮干溶劑后浸漬于顯色劑溶液中進(jìn)行顯色反應(yīng)；在可見光下進(jìn)行檢視：出現(xiàn)的白色或黃色或棕色背景下的藍(lán)色斑點(diǎn)即為α-淀粉酶抑制劑。本發(fā)明專利技術(shù)提供了一種可方便、快捷地篩選α-淀粉酶抑制劑的方法，為從天然物質(zhì)中篩選出具有α-淀粉酶抑制活性成分的研究提供了一條理想途徑。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
一種篩選α–淀粉酶抑制劑的方法
本專利技術(shù)是涉及一種篩選α–淀粉酶抑制劑的方法，具體說，是涉及一種利用薄層色譜-生物自顯影技術(shù)篩選α–淀粉酶抑制劑的方法。
技術(shù)介紹
糖尿病是一種因體內(nèi)胰島素絕對或相對分泌不足所致的內(nèi)分泌代謝疾病，具有高致死率、高致殘率和高醫(yī)療費(fèi)的特征，是繼腫瘤、心腦血管病變之后第三大嚴(yán)重威脅人類健康的慢性非傳染性疾病。目前臨床降糖藥有磺脲類、雙胍類、胰島素增敏藥、非磺脲類胰島素促泌藥、葡萄糖苷酶抑制劑等，其中，α–葡萄糖苷酶抑制劑是通過競爭性抑制小腸上皮絨毛膜上的糖苷酶的作用來減少糖類的降解，延緩糖類的消化和吸收，從而有效地降低糖尿病人餐后血糖濃度。胰α–淀粉酶是消化系統(tǒng)中的另一個(gè)關(guān)鍵酶，屬于α–糖苷酶范疇。胰α–淀粉酶是淀粉的第一步水解酶，將淀粉水解成小分子寡糖，包括麥芽糖、麥芽三糖和許多α–(l–6)和α–(l–4)寡糖。這些寡糖在α–葡萄糖苷酶的作用下進(jìn)一步降解為葡萄糖，吸收入血液循環(huán)。因此，胰α–淀粉酶能導(dǎo)致對膳食淀粉的快速降解，從而升高餐后血糖(PPHG)。20世紀(jì)70年代，人們開始意識到一些抑制劑能夠抑制或部分抑制小腸二糖酶和胰α–淀粉酶的活性，這些抑制劑可以用來口服治療非胰島素依賴型(2型糖尿病)糖尿病。因此，α–淀粉酶抑制劑在治療2型糖尿病方面具有重要意義。目前，臨床主要應(yīng)用的α–淀粉酶抑制劑如阿卡波糖等存在一系列副作用，例如：胃腸脹氣、腹痛、腹瀉等。相比之下，天然物質(zhì)來源的α–淀粉酶抑制劑因其作用溫和、毒副作用小、來源廣泛等優(yōu)勢突顯，因此，得到研究者的廣泛關(guān)注。而現(xiàn)有技術(shù)采用的體內(nèi)、體外多種實(shí)驗(yàn)篩選方法，對試驗(yàn)化合物的純度及用量均有較高要求，存在篩選難度大、成本高等缺陷。尤其是，天然物質(zhì)的有效成分通常不夠明確，且活性效果大多由多成分、多靶點(diǎn)的協(xié)同作用產(chǎn)生，采用現(xiàn)有技術(shù)的篩選方法對來源于天然物質(zhì)的α–淀粉酶抑制劑進(jìn)行篩選時(shí)，會存在更大困難，不僅耗時(shí)費(fèi)力，而且復(fù)雜低效。因此，研究一種可快速篩選α–淀粉酶抑制劑的方法，對篩選來源于天然物質(zhì)的α–淀粉酶抑制劑將具有重要意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本專利技術(shù)的目的是提供一種篩選α–淀粉酶抑制劑的方法，利用薄層色譜-生物自顯影技術(shù)，實(shí)現(xiàn)快速、低成本、高靈敏度和專屬性地篩選α–淀粉酶抑制劑。為實(shí)現(xiàn)上述專利技術(shù)目的，本專利技術(shù)采用的技術(shù)方案如下：一種篩選α–淀粉酶抑制劑的方法，包括如下步驟：a)配制酶促反應(yīng)緩沖液、底物溶液、α-淀粉酶溶液、顯色劑溶液和供試品溶液，備用；所述的酶促反應(yīng)緩沖液選用pH值為6.5～9.0的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液；所述的底物溶液選用pH值為6.0～7.0、含0.05wt％～1wt％可溶性淀粉的磷酸鹽緩沖溶液；所述的α-淀粉酶溶液選用含α-淀粉酶的活性濃度≥6U/mL的酶促反應(yīng)緩沖液；所述的顯色劑溶液選用碘含量為0.1～20mg/mL的碘-碘化鉀水溶液；b)將供試品溶液點(diǎn)樣于薄層板上，揮去溶劑后備用或使用適宜的展開劑展開后取出、晾干備用；c)將經(jīng)步驟b)處理后的薄層板浸漬于底物溶液中，然后取出、揮干溶劑；d)將經(jīng)步驟c)處理后的薄層板浸漬于α-淀粉酶溶液中，在5～50℃進(jìn)行酶促反應(yīng)10～60分鐘；反應(yīng)完成后，取出薄層板、揮干溶劑；e)將經(jīng)步驟d)處理后的薄層板浸漬于顯色劑溶液中進(jìn)行顯色反應(yīng)；f)對經(jīng)步驟e)顯色后的薄層板進(jìn)行檢視：在可見光下出現(xiàn)的白色或黃色或棕色背景下的藍(lán)色斑點(diǎn)即為α-淀粉酶抑制劑。作為優(yōu)選方案，所述的酶促反應(yīng)緩沖液由三羥甲基氨基甲烷與鹽酸及氯化鈣形成，其中的三羥甲基氨基甲烷的摩爾濃度為25～80mmol/L。作為優(yōu)選方案，所述的磷酸鹽緩沖溶液由磷酸二氫鈉與磷酸氫二鈉形成，且所形成的磷酸鹽的摩爾濃度為15～25mmol/L。作為優(yōu)選方案，所述的顯色劑溶液由碘化鉀與碘按質(zhì)量比為3:1形成的碘含量為1～5mg/mL的水溶液。作為優(yōu)選方案，所述的薄層板選用硅膠板、聚酰胺板、纖維素板中的任意一種。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)具有如下有益效果和顯著性進(jìn)步：1)無需復(fù)雜的儀器和設(shè)備，操作簡單，實(shí)驗(yàn)耗費(fèi)低，適合一般實(shí)驗(yàn)室操作，而且靈敏度和專屬性高于常規(guī)篩選方法；2)篩選結(jié)果形象直觀，易于辨識和記憶；3)篩選過程以薄層板為媒介，不受溶劑和供試品濃度的限制，使得受試樣品的選擇范圍更為廣泛；總之，本專利技術(shù)提供了一種可方便、快捷地篩選α–淀粉酶抑制劑的方法，為從天然物質(zhì)中篩選出具有α-淀粉酶抑制活性成分的研究提供了一條理想途徑，具有顯著性應(yīng)用價(jià)值。附圖說明圖1為實(shí)施例1采用本專利技術(shù)的篩選方法對阿卡波糖抑制α–淀粉酶活性能力的檢視結(jié)果。圖2為實(shí)施例2對所用底物溶液中所含的可溶性淀粉的適宜濃度范圍的驗(yàn)證結(jié)果；其中：A板所用的底物溶液中含可溶性淀粉為0.05wt％，B板所用的底物溶液中含可溶性淀粉為1wt％。圖3為實(shí)施例3對所用顯色劑溶液中所含碘的適宜濃度范圍的驗(yàn)證結(jié)果；其中：A板所用的顯色劑溶液中碘含量為0.1mg/mL，B板所用的顯色劑溶液中碘含量為20mg/mL。圖4為實(shí)施例4對所用α-淀粉酶溶液中所含α-淀粉酶的適宜活性濃度范圍的驗(yàn)證結(jié)果；其中：A板所用的α-淀粉酶溶液中含α-淀粉酶的活性濃度為6U/mL，B板所用的α-淀粉酶溶液中含α-淀粉酶的活性濃度為120U/mL。圖5為實(shí)施例5對酶促反應(yīng)的適宜溫度范圍的驗(yàn)證結(jié)果；其中：A板所用的酶促反應(yīng)溫度為5℃，B板所用的酶促反應(yīng)溫度為50℃。圖6為實(shí)施例6對酶促反應(yīng)的適宜時(shí)間范圍的驗(yàn)證結(jié)果；其中：A板所用的酶促反應(yīng)時(shí)間為10分鐘，B板所用的酶促反應(yīng)時(shí)間為60分鐘。圖7為實(shí)施例7對紫蘇子、女貞子和黃芩提取物在不同檢視條件下檢視結(jié)果對比；其中：A圖是在254nm波長光照下的檢視結(jié)果，B圖是在366nm波長光照下的檢視結(jié)果，C圖是在可見光下的檢視結(jié)果。圖8為實(shí)施例8采用本專利技術(shù)的篩選方法對羅格列酮、米格列醇、齊墩果酸和木犀草素對α–淀粉酶的抑制能力的篩選結(jié)果；其中：A為阿卡波糖；B為羅格列酮；C為米格列醇；D為齊墩果酸；E為木犀草素。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本專利技術(shù)的技術(shù)方案做進(jìn)一步闡述：實(shí)施例1一、溶液配制酶促反應(yīng)緩沖液的配制：將302.5mg三羥甲基氨基甲烷和330mg無水氯化鈣溶于水中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.5，然后加水定容至100mL，即得pH為7.5、三羥甲基氨基甲烷的摩爾濃度為25mmol/L的酶促反應(yīng)緩沖液，置于2～4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩５孜锶芤旱呐渲疲簩?12mgNaH2PO4·2H2O和716mgNa2HPO4·12H2O溶于100mL去離子水中，調(diào)節(jié)pH為6.9，即得pH為6.9、磷酸鹽濃度為20mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液；取1g可溶性淀粉溶于100mL上述磷酸鹽緩沖溶液中，在95℃水浴加熱4小時(shí)后，放冷，于8000轉(zhuǎn)/分鐘下離心10分鐘，所得上清液即為pH值為6.9、含1wt％可溶性淀粉的磷酸鹽緩沖溶液的底物溶液，置于2～4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩＆?淀粉酶溶液的配制：將α-淀粉酶加入上述酶促反應(yīng)緩沖液中，配制成α-淀粉酶的活性濃度為6U/mL的α-淀粉酶溶液。顯色劑溶液的配制：將碘化鉀和碘按質(zhì)量比3:1溶于去離子水中，配制成碘含量為2mg/mL的顯色劑溶液。供試品溶液的配制：將5mg阿卡波糖(Acarbose)粉末溶于100mL甲醇中，配制本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種篩選α–淀粉酶抑制劑的方法，其特征在于，包括如下步驟：a)配制酶促反應(yīng)緩沖液、底物溶液、α?淀粉酶溶液、顯色劑溶液和供試品溶液，備用；所述的酶促反應(yīng)緩沖液選用pH值為6.5～9.0的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液；所述的底物溶液選用pH值為6.0～7.0、含0.05wt％～1wt％可溶性淀粉的磷酸鹽緩沖溶液；所述的α?淀粉酶溶液選用含α?淀粉酶的活性濃度≥6U/mL的酶促反應(yīng)緩沖液；所述的顯色劑溶液選用碘含量為0.1～20mg/mL的碘?碘化鉀水溶液；b)將供試品溶液點(diǎn)樣于薄層板上，揮去溶劑后備用或使用適宜的展開劑展開后取出、晾干備用；c)將經(jīng)步驟b)處理后的薄層板浸漬于底物溶液中，然后取出、揮干溶劑；d)將經(jīng)步驟c)處理后的薄層板浸漬于α?淀粉酶溶液中，在5～50℃進(jìn)行酶促反應(yīng)10～60分鐘；反應(yīng)完成后，取出薄層板、揮干溶劑；e)將經(jīng)步驟d)處理后的薄層板浸漬于顯色劑溶液中進(jìn)行顯色反應(yīng)；f)對經(jīng)步驟e)顯色后的薄層板進(jìn)行檢視：在可見光下出現(xiàn)的白色或黃色或棕色背景下的藍(lán)色斑點(diǎn)即為α?淀粉酶抑制劑。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種篩選α–淀粉酶抑制劑的方法，其特征在于，包括如下步驟：a)配制酶促反應(yīng)緩沖液、底物溶液、α-淀粉酶溶液、顯色劑溶液和供試品溶液，備用；所述的酶促反應(yīng)緩沖液選用pH值為6.5～9.0的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液，是由三羥甲基氨基甲烷與鹽酸及氯化鈣形成，其中的三羥甲基氨基甲烷的摩爾濃度為25～80mmol/L；所述的底物溶液選用pH值為6.0～7.0、含0.05wt％～1wt％可溶性淀粉的磷酸鹽緩沖溶液；所述的α-淀粉酶溶液選用含α-淀粉酶的活性濃度≥6U/mL的酶促反應(yīng)緩沖液；所述的顯色劑溶液選用碘含量為0.1～20mg/mL的碘-碘化鉀水溶液；b)將供試品溶液點(diǎn)樣于薄層板上，揮去溶劑后備用或使用適宜的展開劑展開后取出、晾干備用；c)將經(jīng)步驟b)處理后的薄層板浸漬于底物溶...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：谷麗華，江悅，侴桂新，王崢濤，
申請(專利權(quán))人：上海中醫(yī)藥大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：上海;31