一種裸鼴鼠皮層神經元培養方法技術

本發明專利技術涉及細胞生物學技術領域，特別涉及一種裸鼴鼠皮層神經元的分離純化和培養方法。本發明專利技術綜合使用多種培養基從新生裸鼴鼠大腦皮層分離并純化培養皮層神經元，摸索出了適于變溫的嚙齒類哺乳動物裸鼴鼠皮層神經元的合理培養方法。本發明專利技術方法能夠簡便、高效、經濟的獲得大量功能活性正常的裸鼴鼠皮層神經元，低氧條件下的培養能夠保證這種細胞在離體環境中依然能夠保持在體狀態下的生物學特性，從而便于直接在純凈的體外細胞培養模型中進一步研究裸鼴鼠皮層神經元的特殊生理功能，從而為探索其中的生物學機制并應用于臨床相關領域提供重要的理論依據。

【技術實現步驟摘要】

：本專利技術涉及細胞生物學
，具體涉及一種細胞的分離純化及培養方法，特別涉及一種裸鼴鼠皮層神經元的分離純化和培養方法。
技術介紹
：神經元雖然不是是哺乳動物中樞神經系統中比例最高的，但卻是功能最重要的一類細胞，神經元在突觸形成、突觸信號傳遞，以及突觸可塑性中發揮著至關重要的作用。而大腦皮層神經元在機體諸多功能，包括視覺、聽覺、嗅覺、語言、運動、體表感覺等方面發揮著控制中樞的作用。裸鼴鼠是一種變溫哺乳動物，在氧氣濃度僅有6％左右的不通風洞穴中能夠保持腦結構和功能的完整無損并進行正常的生命活動。裸鼴鼠常年生活與地下黑暗狹窄的洞穴中，裸鼴鼠視覺功能嚴重退化，只能感受到無定形的光線信號，但無法接收清晰的圖像信號，視覺中樞萎縮，遠不及其他視力正常的嚙齒類動物(MillsSL,CataniaKS(2004)Identificationofretinalneuronsinaregressiverodenteye(thenakedmole-rat).VisNeurosci21:107-117.；NikitinaN,Maughan-BrownB,RiainMO,KidsonS(2004)Postnataldevelopmentoftheeyeinthenakedmolerat(Heterocephalusglaber).AnatRecADiscovMolCellEvolBiol277:317-337.；HetlingJR,Baig-SilvaMS,ComerCM,etal.(2005)Featuresofvisualfunctioninthenakedmole-ratHeterocephalusglaber.JCompPhysiolANeuroetholSensNeuralBehavPhysiol191:317-330.)。聽覺系統及聽力也到了一定程度的削弱。首先外耳廓在進化過程中消失，在耳開口處只有由皮膚組成的環狀結構。其次，其聲源定位能力障礙，只能辨識以泥土為傳播介質的低頻聲音(HeffnerRS,HeffnerHE(1993)Degeneratehearingandsoundlocalizationinnakedmole-rats(Heterocephalusglaber)withanoverviewofcentralauditorystructures.JCompNeurol331:418-433.)。另外其對空氣中傳播的氣味分子的嗅覺能力嚴重受限。但是，裸鼴鼠其他功能則代償性增強：其發達的終生保持增生能力且功能強大的切牙可以從事高強度的挖掘工作；在與其身體直徑相當的洞穴中，裸鼴鼠主要依賴其體表數根觸須發揮的觸覺功能代償其嚴重退化的視力和聽力。這些生理功能的變化可能主要是其腦內對應腦區的形態結構和功能出現適應性的變化造成的(CataniaKC,RempleMS(2002)Somatosensorycortexdominatedbytherepresentationofteethinthenakedmole-ratbrain.ProcNatlAcadSciUSA99:5692-5697.；CrishSD,RiceFL,ParkTJ,ComerCM(2003)Somatosensoryorganizationandbehaviorinnakedmole-ratsI:vibrissa-likebodyhairscompriseasensoryarraythatmediatesorientationtotactilestimuli.BrainBehavEvol62:141-151.；ParkTJ,ComerC,CarolA,etal.(2003)Somatosensoryorganizationandbehaviorinnakedmole-rats:II.Peripheralstructures,innervation,andselectivelackofneuropeptidesassociatedwiththermoregulationandpain.JCompNeurol465:104-120.；HenryEC,RempleMS,O'RiainMJ,CataniaKC(2006)Organizationofsomatosensorycorticalareasinthenakedmole-rat(Heterocephalusglaber).JCompNeurol495:434-452.)。裸鼴鼠大腦皮層功能及其機制的闡明除了需要在體功能的研究，還需要對其特定大腦皮層神經元的研究，這就依賴于其大腦皮層純化培養的神經元。目前，研究人員已經建立出大鼠及小鼠皮層神經元的培養方法(LinGang,Yu-chenYao,Ying-fuLiu,Yi-pengLi,KaiYang,LeiLu,Yuan-chiCheng,Xu-yiChen,andYueTu.Co-cultureofoligodendrocytesandneuronscanbeusedtoassessdrugsforaxonregenerationinthecentralnervoussystem.NeuralRegenRes.2015；10(10):1612–1616.)。中國專利申請CN201110164446.4，申請公布號為CN102839151A，公開了一種胎鼠皮層神經元的原代無血清培養方法，所述的培養基為胰島素－轉鐵蛋白－亞硒酸鈉無血清培養基，其中含有0.5g/L胰島素、0.5g/L轉鐵蛋白和0.5mg/L亞硒酸鈉。中國專利申請CN201510072161.6，申請公布號為CN104611294A，公開了一種大鼠視皮層神經元體外培養方法，貼壁培養時先用接種培養基，18h后用維持培養基全換液；所述的接種培養基為DMEM/F12培養基中加入體積比為10％的馬血清、2×105U/L的青鏈霉素和0.5mmol/L的L-谷氨酰氨；所述的維持培養基指NeurobasalMedium無血清培養基中加入體積比為2％的B27血清替代物和2×105U/L的青鏈霉素以及0.5mmol/L的L-谷氨酰氨。但是現有技術中無論小鼠還是大鼠的皮層神經元分離純化和培養方法均不適用于裸鼴鼠，目前國內外文獻尚無有關裸鼴鼠皮層神經元分離純化和培養方法的相關報道。
技術實現思路
：本專利技術的目的在于提供一種裸鼴鼠皮層神經元的分離純化和培養方法，以便捷、高效的獲得純度高、狀態好的裸鼴鼠皮層神經元，為體外建立裸鼴鼠皮層神經元提供技術支持，同時為體外研究本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種裸鼴鼠皮層神經元培養方法，包括以下步驟：A、收集裸鼴鼠皮層混合神經細胞：分離65?70天的胚胎裸鼴鼠大腦皮層組織，將大腦皮層組織剪碎，加入組織消化液混勻之后，于35?37℃消化15?30分鐘；然后用混合神經細胞培養基終止消化，離心去除上清之后，在混合神經細胞培養基中將沉淀重懸并吹打成單細胞懸液；將單細胞懸液種于無菌且預先包被有基質層的培養板中；B、裸鼴鼠大腦皮層混合神經細胞的培養：將步驟A得到的混合神經細胞，用混合神經細胞培養基培養于三氣培養箱中培養6?10個小時，待其完全貼壁之后，更換為神經元純化培養基繼續培養2?4天，然后將培養基更換為神經元維持培養基繼續培養2?4天，如此為一個循環，培養2?4個循環；所述的神經元純化培養基為含有10μM?5?氟尿嘧啶的Nerobasal培養基并添加體積分數為2％的B27；所述的神經元維持培養基為含有體積百分數為2％B27的Neurobasal培養基，同時添加100ng/ml?NGF；所述的三氣培養箱的參數設置為：溫度控制在35±2℃，氧濃度為5％，二氧化碳濃度為5±1％，濕度為96±2％。

【技術特征摘要】
1.一種裸鼴鼠皮層神經元培養方法，包括以下步驟：
A、收集裸鼴鼠皮層混合神經細胞：
分離65-70天的胚胎裸鼴鼠大腦皮層組織，將大腦皮層組織剪碎，加入
組織消化液混勻之后，于35-37℃消化15-30分鐘；然后用混合神經細胞培
養基終止消化，離心去除上清之后，在混合神經細胞培養基中將沉淀重懸
并吹打成單細胞懸液；將單細胞懸液種于無菌且預先包被有基質層的培養
板中；
B、裸鼴鼠大腦皮層混合神經細胞的培養：
將步驟A得到的混合神經細胞，用混合神經細胞培養基培養于三氣培
養箱中培養6-10個小時，待其完全貼壁之后，更換為神經元純化培養基繼
續培養2-4天，然后將培養基更換為神經元維持培養基繼續培養2-4天，如
此為一個循環，培養2-4個循環；
所述的神經元純化培養基為含有10μM5-氟尿嘧啶的Nerobasal培養
基并添加體積分數為2％的B27；
所述的神經元維持培養基為含有體積百分數為2％B27的Neurobasal培
養基，同時添加100ng/mlNGF；
所述的三氣培養箱的參數設置為：溫度控制在35±2℃，氧濃度為5％，
二氧化碳濃度為5±1％，濕度為96±2％。
2.根據權利要求1所述的...

【專利技術屬性】
技術研發人員：崔淑芳，楊文靜，孫偉，湯球，肖邦，趙善民，叢薇，程繼帥，
申請(專利權)人：中國人民解放軍第二軍醫大學，
類型：發明
國別省市：上海;31