本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種檢測TrkB受體pan-Tyr位點(diǎn)激活水平的ELISA試劑盒，能在來自E17胚胎的大鼠原代皮層神經(jīng)元細(xì)胞中定量檢測內(nèi)源性TrkB受體受到其同親配體BDNF刺激后的激活水平。BDNF能誘導(dǎo)TrkB受體胞內(nèi)段多個酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化，該誘導(dǎo)具有時間依賴性和劑量依賴性。這一過程可在TrkB受體固定在96孔板后使用TrkC-14抗體以及磷酸化的酪氨酸抗體（抗PY99泛用抗體）檢測。因此，本發(fā)明專利技術(shù)為在原代神經(jīng)元培養(yǎng)物和腦組織中定量檢測內(nèi)源性TrkB受體的激活水平提供了一個強(qiáng)大的工具。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于醫(yī)學(xué)生物
，涉及一種檢測TrkB受體pan-Tyr位點(diǎn)激活水平的ELISA試劑盒及其使用方法。
技術(shù)介紹
腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的成員，該家族包括神經(jīng)生長因子(NGF)，NT-3, NT-4/5(Thoenen, 1991)。BDNF,如同其他神經(jīng)營養(yǎng)因子，具有通過TrkB受體酪氨酸激酶通路影響神經(jīng)元細(xì)胞的生物學(xué)活性(Huang et al. , 2008;Kaplan andMiller, 2000)。TrkB是腦中分布最廣泛的神經(jīng)營養(yǎng)因子之一，且在大腦皮層，海馬，紋狀體，腦干中高度富集(Shelton et al.，1995)。BDNF結(jié)合到TrkB能觸發(fā)后者的二聚化，這一過程是通過順應(yīng)性改變和酪氨酸殘基的自磷酸化實(shí)現(xiàn)的，其結(jié)果將導(dǎo)致包括促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和磷脂酶C-gl (PLC-gl)在內(nèi)的三條主要信號通路的激活。BDNF/TrkB信號通路在許多細(xì)胞過程如突觸可塑性和神經(jīng)保護(hù)作用中扮演了關(guān)鍵性角色(Hennigan et al. , 2007;Nagappan and Lu, 2005)。例如,BDNF能保護(hù)海馬免受谷氨酸中毒且能拯救小腦神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞程序性死亡(Leeds et al.，2005)。BDNF對參與多種神經(jīng)變性性疾病的神經(jīng)細(xì)胞，如參與外周感覺病變的感覺神經(jīng)元(Lindsay，1996)，在帕金森氏病中缺失的黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元及參與阿爾茲海默癥的基底前腦膽堿能神經(jīng)元(Siegel and Chauhan, 2000),都具有神經(jīng)營養(yǎng)作用，故而已經(jīng)成為治療領(lǐng)域研究熱點(diǎn)之一。最近，越來越多的證據(jù)表明這些分子也參與到神經(jīng)發(fā)生和抗抑郁藥物作用過程。抗抑郁藥物能誘導(dǎo)BDNF信使RNA (mRNA)的表達(dá)，以及TrkB的自磷酸化激活過程(Nibuya etal. , 1995; Saarelainen et al. , 2003),在小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中，抗抑郁藥物對BDNF單等位基因激活小鼠(BDNF+/mice)，前腦BDNF特異性完全缺失小鼠，及表達(dá)顯性失活TrkB(trkB.Tl)小鼠的作用藥效降低(Monteggia et al. , 2004; Saarelainen et al.，2003)。因此，BDNF/TrkB在多種神經(jīng)學(xué)過程都扮演了重要角色。Trk受體的激活導(dǎo)致在該受體胞內(nèi)段10個進(jìn)化保守的酪氨酸殘基中的若干發(fā)生磷酸化。其中3個(在人類是第670、674、675位酪氨酸)位于激酶結(jié)構(gòu)域的激活環(huán)。這些殘基的磷酸化可以增強(qiáng)酪氨酸激酶的活性，這種增強(qiáng)是通過將這些帶負(fù)電荷的磷酸化酪氨酸殘基與其附近的堿性氨基酸殘基配對而實(shí)現(xiàn)的。更多的磷酸化酪氨酸可以提供能與含有多聚嘧啶串結(jié)合蛋白(PTB)結(jié)構(gòu)域或肉瘤病毒編碼蛋白同源結(jié)構(gòu)域2型(SH2)的蛋白結(jié)合的停泊位點(diǎn)。細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件能夠被這些受體蛋白激活，包括大鼠肉瘤蛋白(Ras)-快速生長纖維瘤蛋白(Raf) -MAPK，PI3K-Akt，磷脂酶C (PLC)-y-鈣離子(Ca2+)，核轉(zhuǎn)錄因子(NFkB),以及非典型蛋白激酶C信號通路。當(dāng)前研究已經(jīng)關(guān)注于一對磷酸化酪氨酸之間的相互作用。第490位和785位的酪氨酸是不在激酶激活結(jié)構(gòu)域內(nèi)的主要的磷酸化酪氨酸(Stephens et al. , 1994)。TrkA和TrkB的磷酸化位點(diǎn)都是各自對應(yīng)保守的TrkA第490位酪氨酸對應(yīng)TrkB第512位酪氨酸，TrkA第674/675位酪氨酸對應(yīng)TrkB第706/707位酪氨酸，TrkA第785位酪氨酸對應(yīng)第817位酪氨酸(人源，在小鼠是第816位)(Huang andReichardt, 2003)。目前檢測這些信號通路激活的方法中，各種針對TrkB受體特定磷酸化位點(diǎn)的抗體的免疫印跡法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用。盡管定量ELISA檢測磷酸化的TrkB的試劑盒已經(jīng)可以商業(yè)化購買，但是目前尚只有針對人源TrkB受體的產(chǎn)品。TrkB受體在許多腫瘤組織中高度表達(dá)，如神經(jīng)母細(xì)胞瘤，前列腺癌和胰腺導(dǎo)管腺癌。在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中，當(dāng)促腫瘤生存的自分泌循環(huán)信號通路被過度表達(dá)的BDNF所增強(qiáng)時，TrkB的高度表達(dá)與不利病情轉(zhuǎn)歸的出現(xiàn)息息相關(guān)。因此，這些方法還可以應(yīng)用于檢測人癌細(xì)胞中TrkB的激活。不過，BDNF/TrkB信號通路主要還是在神經(jīng)系統(tǒng)中扮演角色，內(nèi)源性的TrkB受體也處在一個本底水平。所以研究上還是以大鼠或小鼠作為主要實(shí)驗(yàn)對象。然而賽爾新羅公司(Cell Signaling)的ELISA產(chǎn)品并不能滿足這種需要。故而，我們建立了一種檢測TrkB受體816/817位酪氨酸位點(diǎn)激活水平的ELISA試劑盒，可以檢測出大鼠內(nèi)源性TrkB的激活。考慮到不同物種蛋白存在同源性，該試劑盒可應(yīng)用于人，小鼠和大鼠
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)所要解決的技術(shù)問題是提供一種檢測TrkB受體pan-Tyr位點(diǎn)激活水平的ELISA試劑盒。本專利技術(shù)的ELISA試劑盒包括以下組成Trk C-14抗體包被的96孔板；PY-99 抗體，以 1:1000 稀釋于 2%BSA/PBST 溶液；辣根過氧化物酶體標(biāo)記的抗鼠IgG 二抗，1:5000稀釋于2%BSA/PBST溶液。還包括TMB底物溶液，其為將Img TMB溶解于ImL 二甲基亞砜DMSO中，而后加入新鮮配制的9mL pH5. O的檸檬酸鹽緩沖液中，最后加入100 μ I 3%雙氧水H2O2 ； STOP終止溶液，成分為3NHCL ；洗脫緩沖液，其稀釋20倍后的終溶液為PBST溶液；樣品稀釋液，為2%BSA/PBST溶液加入2mM釩酸鈉；細(xì)胞裂解緩沖液，成分為IOOmM β甘油磷酸鈉，500mM Tris-鹽酸(pH 7. 4)，I. 5M氯化鈉，IOmM 乙二胺四乙酸二鈉 EDTA (pH 8. O)，10%Triton X-100, 20mM 釩酸鈉，500mM 氟化鈉，IOOmM焦磷酸鈉，1:10加入西格瑪公司出品的蛋白酶抑制劑混合物，稀釋10倍后使用。本專利技術(shù)的ELISA試劑盒使用方法如下將抗體TrkC-14包被到96孔板中4攝氏度過夜，洗滌。包被后的平板使用2%牛血清白蛋白(BSA)封閉，充分洗滌后孵育以40 μ g溶解于樣品稀釋液中的細(xì)胞蛋白，這些細(xì)胞來自于經(jīng)BDNF(100ng/ml)處理15分鐘的細(xì)胞培養(yǎng)物。平板在4攝氏度下緩速搖過夜，而后再次充分洗滌。接下來用抗PY99孵育平板，4攝氏度過夜。第2天洗滌平板后，再加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鼠二抗。用TMB作為底物檢測信號，因?yàn)門MB可被氧化為藍(lán)色溶液。顏色強(qiáng)度和顯色時間隨檢測的靈敏度和檢測條件不同而改變。當(dāng)反應(yīng)到達(dá)合適的顏色強(qiáng)度時，加入酸性的STOP終止溶液終止反應(yīng)，溶液顏色將由藍(lán)色變?yōu)辄S色。反應(yīng)終止后一個小時內(nèi)檢測結(jié)果可以維持穩(wěn)定，平板應(yīng)及時在450nm下用讀板器分析結(jié)果。此外，我們還檢測了在650nm的吸光度,這個數(shù)值代表平板和溶液本身的本底干擾,故而要用450nm的吸光度減去650nm的吸光度。本專利技術(shù)的ELISA試劑盒及ELISA方法，能定量分析TrkB在原代神經(jīng)培養(yǎng)物中被激活的水平。我們驗(yàn)證了 ELISA實(shí)驗(yàn)的結(jié)果同使用磷酸化TrkB抗體進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性，本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種檢測TrkB受體pan?Tyr位點(diǎn)活性的ELISA試劑盒，其特征在于，包括以下組成:Trk?C?14抗體包被的96孔板；PY?99抗體，以1:1000稀釋于2%BSA/PBST溶液；辣根過氧化物酶體標(biāo)記的抗鼠IgG二抗，1:5000稀釋于2%BSA/PBST溶液。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：葉克強(qiáng)，
申請(專利權(quán))人：武漢遠(yuǎn)征世紀(jì)制藥有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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