【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】專利
本專利技術涉及病毒疫苗組合物的領域。特別地，本專利技術涉及乙型腦炎疫苗組合物以及制備抵抗乙型腦炎感染的疫苗組合物的過程或方法。本專利技術涉及用于生產和純化病毒原液(virusbulk)的方法及其所述乙型腦炎病毒原液的滅活技術。專利技術背景乙型腦炎病毒(JEV)是蚊傳感染，是整個亞洲病毒性腦炎的主要原因，并越過其大陸界限進行傳播。JEV被歸類為黃病毒科(flavivirusfamily)和黃病毒屬(genusflavivirus)。它是包含10.9kb單鏈、反義RNA基因組的小包膜病毒(50nm)。病毒體RNA編碼包括四種結構蛋白和七種非結構蛋白的11種蛋白。在4種結構蛋白之中，表面包膜蛋白(E蛋白)作為細胞受體結合蛋白和融合蛋白，用于病毒附著并進入宿主中。所以抗體抵抗E蛋白中和病毒，并在保護中發揮重要作用。表面結構E蛋白是疫苗的重要組分，因此它對于用合適的疫苗效力穩定劑穩定該蛋白分子是非常重要的。由于疫苗的廣大區域分布和環境溫度的差異，存在改進制備乙型腦炎病毒原液的生物過程用于制備生產用微生物并進一步利用疫苗的需求。乙型腦炎的生物過程包括在滾瓶燒瓶或細胞工廠單位中生長。通過滾瓶細胞培養或通過細胞工廠生產工業量的乙型腦炎疫苗需要較大量的時間，產量相對較少，并且還占用大量空間，這使得在每個細胞工廠中時常并經常難以控制和調節實驗參數。病毒原液的生產因此固有地缺乏操作的均一性。本專利技術通過其新的
【技術保護點】
一種用于預防由乙型腦炎病毒的印度科拉爾毒株引起的感染的病毒疫苗組合物，所述病毒疫苗組合物包含疫苗抗原，其中所述疫苗抗原是滅活的乙型腦炎病毒的科拉爾毒株，所述乙型腦炎病毒的科拉爾毒株適應于在一次性生物反應器中生長的Vero細胞以收獲活乙型腦炎病毒原液。
【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2013.09.14 IN 4135/CHE/20131.一種用于預防由乙型腦炎病毒的印度科拉爾毒株引起的感染的病
毒疫苗組合物，所述病毒疫苗組合物包含疫苗抗原，其中所述疫苗抗原是
滅活的乙型腦炎病毒的科拉爾毒株，所述乙型腦炎病毒的科拉爾毒株適應
于在一次性生物反應器中生長的Vero細胞以收獲活乙型腦炎病毒原液。
2.根據權利要求1所述的疫苗組合物，其中所述疫苗抗原生長在所述
一次性生物反應器中的Vero細胞中以收集活乙型腦炎病毒原液，且所述病
毒原液從Vero細胞的單次培養和所述乙型腦炎病毒的科拉爾毒株的單次
感染收獲多次(多次病毒收獲)，從至少多于一次直至五次或至少三次。
3.根據權利要求1所述的疫苗組合物，其中所述一次性生物反應器在
以下條件下被保持：50ppm-70ppm的范圍內的溶解氧、在35.5℃至37.5℃
之間的溫度范圍、在7.2至7.6的保持的pH、伴隨260rpm至280rpm的
攪拌、80-150ml/min的流入速率和84-156ml/min的流出速率。
4.根據權利要求2所述的疫苗組合物，其中所獲得的多次的病毒收獲
物被進一步純化和滅活，包括以下步驟：
(a)將病毒收獲物用0.45μ膜凈化，以將細胞碎片從所述病毒收獲物去
除；
(b)將收獲物體積用300kDa膜盒濃縮至少4倍，以獲得濃縮的存留物；
(c)使步驟(b)的所濃縮的收獲物存留物通過celufine硫酸酯基質純化，
以收集包含期望的病毒、高量的鹽細胞蛋白和核酸物質的洗脫物，其中所
述基質由纖維素支持基質在活性基團硫酸酯的存在下組成；
(d)使用300kDa膜盒使步驟(c)的所述洗脫物相對磷酸鹽緩沖鹽水進行
滲濾和緩沖液交換至少5-6次，以收集存留物，并將不期望的高量的鹽細
胞蛋白和核酸物質從感興趣的病毒去除，以收集純化的濃縮的病毒原液；
(e)使步驟(d)的所述純化的濃縮的病毒原液經受0.45μ膜過濾，以消除
過程中的任何污染物；
(f)將步驟(e)的純化的病毒用1:1500v/v至1:2500v/v之間的比率的福
爾馬林(即1體積的福爾馬林處理2500體積的活JE)連同穩定劑在22℃持
續7天的時間段來同時穩定化和滅活，其中所述穩定劑由甘氨酸和山梨醇
組成，或者用1:1500v/v至1:2500v/v之間的比率的β-丙內酯(即1體積福
爾馬林處理2500體積的活JE)連同穩定劑在5℃±3℃持續7天的時間段來
同時穩定化和滅活，其中所述穩定劑由甘氨酸和山梨醇組成；
(g)僅在福爾馬林滅活的情況中，使用300kDa膜盒使步驟(f)的滅活的
純化的病毒原液相對磷酸鹽緩沖鹽水進行滲濾和緩沖液交換至少5-6次，
以去除福爾馬林；
(h)將步驟(g)的純化的滅活的病毒原液用0.22μ膜過濾，以獲得在5℃
±3℃持續至少24個月至36個月不含任何污染物、適合于配制乙型腦炎
疫苗的最終且穩定的滅活的JEV原液。
5.根據權利要求2所述的疫苗組合物，其中所獲得的多次的病毒收獲
物被進一步純化和滅活，包括以下步驟：
(a)將病毒收獲物用0.45μ膜凈化，以將細胞碎片從所述病毒收獲物去
除；
(b)通過組合的尺寸排阻和親和層析術利用CaptoCore-700基質來純
化，以獲得包含純化的病毒的流出物，其中所述基質由高度交聯的瓊脂糖
基質與官能活性配體辛胺基團組成；
(c)將步驟(b)的所述流出物使用300kDa膜盒來濃縮和滲濾，以獲得純
化的濃縮的病毒原液；
(d)使步驟(c)的所述純化的濃縮的病毒原液經受0.45μ膜過濾，以消除
過程中的任何污染物；
(e)將步驟(d)的純化的病毒用1:1500v/v至1:2500v/v之間的比率的福
爾馬林(即1體積的福爾馬林處理2500體積的活JE)連同穩定劑在22℃持
續7天的時間段來同時穩定化和滅活，其中所述穩定劑由甘氨酸和山梨醇
組成，或者用1:1500v/v至1:2500v/v之間的比率的β-丙內酯(即1體積福
爾馬林處理2500體積的活JE)連同穩定劑在5℃±3℃持續7天的時間段來
\t同時穩定化和滅活，其中所述穩定劑由甘氨酸和山梨醇組成；
(f)僅在福爾馬林滅活的情況中，使用300kDa膜盒使步驟(e)的滅活的
純化的病毒原液相對磷酸鹽緩沖鹽水滲濾和緩沖液交換至少5-6次，以去
除福爾馬林；
(g)將步驟(f)的純化的滅活的病毒原液用0.22μ膜過濾，以獲得在5℃
±3℃持續至少24個月至36個月不含任何污染物、適合于配制乙型腦炎
疫苗的最終且穩定的滅活的JEV原液。
6.一種使乙型腦炎病毒的科拉爾毒株在能夠在一次性生物反應器中
工業化生產的Vero細胞中適應以收集活乙型腦炎病毒原液的方法，且所述
病毒原液從Vero細胞的單次培養和所述乙型腦炎病毒的科拉爾毒株的單
次感染收獲多次(多次病毒收獲)，從至少多...
【專利技術屬性】
技術研發人員：克里什納·莫漢·瓦德雷夫，文卡特桑·拉馬沙米，普拉桑納·庫馬爾·杜夫魯，
申請(專利權)人：巴拉特生物技術國際有限公司，
類型：發明
國別省市：印度;IN
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