篩選三陰性乳腺癌特異性血清代謝標志物的方法技術

本發明專利技術公開了一種篩選三陰性乳腺癌特異性血清代謝標志物的方法，采用LC/MS儀器分別對實驗組A和對照組B的血清樣本進行代謝組學分析，對所有樣本中物質的峰的響應強度數據進行模型判別分析，分別對實驗組A和對照組B進行PCA分析，并在此基礎上進行PLS?DA、OPLS?DA的模型構建，從而獲得差異性表達代謝物，篩選并鑒定與乳腺癌發生、轉移相關的生物標志物：溶血性卵磷脂、鞘磷脂和小分子氨基酸。其結果對于闡明三陰性乳腺癌患者血清特征性代謝物含量變化規律以及代謝物在腫瘤的發生發展過程中的作用具有重要的意義；同時應用此篩選方法可以獲得有效的乳腺癌早期診斷靶點，并為建立特異性癌癥診斷模型提供數據基礎。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種代謝組學對腫瘤引起機體代謝變化做出整體評價并篩選出有價值的生物標志物的方法，尤其涉及一種篩選三陰性乳腺癌特異性血清代謝標志物的方法。
技術介紹
代謝組學(metabolomics)是近年來發展起來的一項技術，用于評估生物樣品在受到環境或其他因素刺激下，其中的各種小分子化合物的變化情況。腫瘤的早發現、早治療及個性化診療方案是腫瘤治療的發展方向，新興的代謝組學開辟了輔助腫瘤早期診斷、療效評價及預后判斷的新思路。腫瘤的發生、發展伴隨著機體代謝產物的變化，代謝組學能對腫瘤引起的機體代謝變化做出整體評價，篩選出有價值的生物標志物，用于腫瘤的早期診治。但現有技術中，并沒有一種篩選三陰性乳腺癌引起機體代謝變化的生物標志物的方法。
技術實現思路
針對現有技術中存在的上述不足，本專利技術提供了一種篩選三陰性乳腺癌特異性血清代謝標志物的方法。為了解決上述技術問題，本專利技術采用了如下技術方案：篩選三陰性乳腺癌特異性血清代謝標志物的方法，該方法包括如下步驟：(1)選取多個三陰性乳腺癌女性患者血清作為實驗組A；選取與實驗組A數量相等的正常女性血清作為對照組B；(2)室溫解凍實驗組A和對照組B的血清后，分別精準吸取100μL血清樣本在不同的1.5mLEP管中，采用甲醇沉淀蛋白，其比例為樣品：甲醇＝1:4，渦旋30s，進行4℃，12000rpm離心15min，吸取200μL上清液，轉入的進樣小瓶中待檢測；>(3)將不同血清樣本的小瓶分別放置在LC-Q/TOF-MS實驗儀器的分析平臺上進行色譜分離和質譜檢測；色譜分離條件為：柱溫為40℃，流速0.35mL/min；流動相組成：①實驗組A為：水+0.1％甲酸；②對照組B為：乙腈+0.1％甲酸；進樣量為4μL，自動進樣器溫度4℃；質譜條件：①采用正離子模式進行檢測條件：以氮氣作為霧化、錐孔氣；飛行管檢測模式V型，毛細管電壓4kV、錐孔電壓35kV、離子源溫度100℃；脫溶劑氣溫度350℃、反向錐孔氣流50L/h、脫溶劑氣600L/h、萃取錐孔4V；②負離子模式條件：毛細管電壓3.5kV、錐孔電壓50kV、離子源溫度100℃；脫溶劑氣溫度300℃、反向錐孔氣流50L/h、脫溶劑氣700L/h、萃取錐孔4V；離子掃描時間0.03s、掃描時間間隔0.02s、數據采集范圍：50-1000m/z；(4)通過MassProfiler軟件對LC-Q/TOF-MS實驗儀器獲得的LC/MS數據進行預處理，并在EXCEL2010軟件中進行后期編輯，將最終結果組織為二維數據矩陣，包括變量、觀察量和峰強；然后將所有數據歸一化到總信號積分；(5)將編輯后的數據矩陣導入SIMCA-P軟件進行主成分分析，獲得正模式下的主成分和負模式下的主成分累積R2X值和Q2值，R2X值為模型的解釋率，Q2值為模型的預測率；(6)采用監督性的偏最小二乘方判別分析PLS-DA對兩組樣本進行分析，其模型質量參數為：正模式下的主成分和負模式下的主成分累積R2X值、R2Y值和Q2值；R2X值為模型的解釋率，R2Y值為模型的解釋率，Q2值為模型的預測率；(7)進一步采用監督式方法OPLS-DA進行建模分析，獲得正模式下的主成分和負模式下的主成分累積R2X值、R2Y值和Q2值，R2X值為模型的解釋率，R2Y值為模型的解釋率，Q2值為模型的預測率；(8)采用OPLS-DA模型的VIP值，并結合t-test的p值來尋找差異性表達代謝物；差異性代謝物的定性方法為：搜索在線數據庫，比較質譜的質荷比m/z或者精確分子質量mass；篩選并鑒定與三陰性乳腺癌發生、轉移相關的生物標志物為：溶血性卵磷脂、鞘磷脂和小分子氨基酸。作為本專利技術的一種優選方案，將編輯后的數據矩陣導入SIMCA-P軟件進行主成分分析前，對數據組進行歸一化處理。與現有技術相比，本專利技術具有如下優點：1、在利用高通量、高靈敏度、快速的LC-Q/TOF-MS技術，對三陰性乳腺癌患者以及正常人的血清進行代謝組學分析并比對，從而尋找乳腺癌早期診斷的特異性的血清代謝標志物。其結果對于闡明三陰性乳腺癌患者血清特征性代謝物含量變化規律以及代謝物在腫瘤的發生發展過程中的作用具有重要的意義。2、應用此篩選方法可以獲得有效的乳腺癌早期診斷靶點，并為建立特異性癌癥診斷模型提供數據基礎。附圖說明圖1為實驗組A單個樣本離子流色譜圖(A:pos,B:neg)；圖2為A-B及QC的PCA得分圖(pos)；圖3為A-B及QC的PCA得分圖(neg)；圖4為A-B兩組的PLS-DA得分圖(pos)；圖5為圖4對應的A-B兩組的PLS-DA排序驗證圖(pos)；圖6為A-B兩組的PLS-DA得分圖(neg)；圖7為圖6對應的A-B兩組的PLS-DA排序驗證圖(neg)；圖8為A-B兩組的OPLS-DA得分圖(pos)；圖9為A-B兩組的OPLS-DA得分圖(neg)。具體實施方式下面結合附圖和具體實施方式對本專利技術作進一步詳細地描述。篩選三陰性乳腺癌特異性血清代謝標志物的方法，該方法包括如下步驟：(1)選取多個三陰性乳腺癌女性患者血清作為實驗組A；選取與實驗組A數量相等的正常女性血清作為對照組B。本實施例中，分析了31例三陰性乳腺癌女性患者血清，并以31例正常女性血清為對照。(2)室溫解凍實驗組A和對照組B的血清后，分別精準吸取100μL血清樣本在不同的1.5mLEP管中，采用甲醇沉淀蛋白，其比例為樣品：甲醇＝1:4，渦旋30s，進行4℃，12000rpm離心15min，吸取200μL上清液，轉入進樣小瓶中待檢測。甲醇為HPLC級甲醇，購自Merck公司(Dannstadt，Gennany)。(3)將不同血清樣本的小瓶分別放置在LC-Q/TOF-MS(Agilent,1290InfinityLC,6530UHDandAccurate-MassQ-TOF/MS)實驗儀器的分析平臺上進行色譜分離和質譜檢測；分離色譜柱為C18色譜柱(Agilent,100mm×2.1mm，1.8μm)。色譜分離條件為：柱溫為40℃，流速0.35mL/min；流動相組成：①實驗組A為：水+0.1％甲酸；②對照組B為：乙腈+0.1％甲酸；梯度洗脫程序見表1。進樣量為4μL，自動進樣器溫度4℃。甲酸購自CNW公司，水為屈臣氏蒸餾水。表1.Thegradientofmobilephase質譜條件：①采用正離子模式進行檢測條件：以氮氣作為霧化、錐孔氣；飛行管檢測模式V型。正本文檔來自技高網...

【技術保護點】
篩選三陰性乳腺癌特異性血清代謝標志物的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟：(1)選取多個三陰性乳腺癌女性患者血清作為實驗組A；選取與實驗組A數量相等的正常女性血清作為對照組B；(2)室溫解凍實驗組A和對照組B的血清后，分別精準吸取100μL血清樣本在不同的1.5mLEP管中，采用甲醇沉淀蛋白，其比例為樣品：甲醇＝1:4，渦旋30s，進行4℃，12000rpm離心15min，吸取200μL上清液，轉入進樣小瓶中待檢測；(3)將不同血清樣本的小瓶分別放置在LC?Q/TOF?MS實驗儀器的分析平臺上進行色譜分離和質譜檢測；色譜分離條件為：柱溫為40℃，流速0.35mL/min；流動相組成：①實驗組A為：水+0.1％甲酸；②對照組B為：乙腈+0.1％甲酸；進樣量為4μL，自動進樣器溫度4℃；質譜條件：①采用正離子模式進行檢測條件：以氮氣作為霧化、錐孔氣；飛行管檢測模式V型，毛細管電壓4kV、錐孔電壓35kV、離子源溫度100℃；脫溶劑氣溫度350℃、反向錐孔氣流50L/h、脫溶劑氣600L/h、萃取錐孔4V；②負離子模式條件：毛細管電壓3.5kV、錐孔電壓50kV、離子源溫度100℃；脫溶劑氣溫度300℃、反向錐孔氣流50L/h、脫溶劑氣700L/h、萃取錐孔4V；離子掃描時間0.03s、掃描時間間隔0.02s、數據采集范圍：50?1000m/z；(4)通過Mass?Profiler軟件對LC?Q/TOF?MS實驗儀器獲得的LC/MS數據進行預處理，并在EXCEL?2010軟件中進行后期編輯，將最終結果組織為二維數據矩陣，包括變量、觀察量和峰強；然后將所有數據歸一化到總信號積分；(5)將編輯后的數據矩陣導入SIMCA?P軟件進行主成分分析，獲得正模式下的主成分和負模式下的主成分累積R2X值和Q2值，R2X值為模型的解釋率，Q2值為模型的預測率；(6)采用監督性的偏最小二乘方判別分析PLS?DA對兩組樣本進行分析，其模型質量參數為：正模式下的主成分和負模式下的主成分累積R2X值、R2Y值和Q2值；R2X值為模型的解釋率，R2Y值為模型的解釋率，Q2值為模型的預測率；(7)進一步采用監督式方法OPLS?DA進行建模分析，獲得正模式下的主成分和負模式下的主成分累積R2X值、R2Y值和Q2值，R2X值為模型的解釋率，R2Y值為模型的解釋率，Q2值為模型的預測率；(8)采用OPLS?DA模型的VIP值，并結合t?test的p值來尋找差異性表達代謝物；差異性代謝物的定性方法為：搜索在線數據庫，比較質譜的質荷比m/z或者精確分子質量mass；篩選并鑒定與三陰性乳腺癌發生、轉移相關的生物標志物為：溶血性卵磷脂、鞘磷脂和小分子氨基酸。...

【技術特征摘要】
1.篩選三陰性乳腺癌特異性血清代謝標志物的方法，其特征在于，該方法包括如下步
驟：
(1)選取多個三陰性乳腺癌女性患者血清作為實驗組A；選取與實驗組A數量相等的正
常女性血清作為對照組B；
(2)室溫解凍實驗組A和對照組B的血清后，分別精準吸取100μL血清樣本在不同的
1.5mLEP管中，采用甲醇沉淀蛋白，其比例為樣品：甲醇＝1:4，渦旋30s，進行4℃，12000rpm
離心15min，吸取200μL上清液，轉入進樣小瓶中待檢測；
(3)將不同血清樣本的小瓶分別放置在LC-Q/TOF-MS實驗儀器的分析平臺上進行色譜
分離和質譜檢測；
色譜分離條件為：柱溫為40℃，流速0.35mL/min；流動相組成：①實驗組A為：水+0.1％
甲酸；②對照組B為：乙腈+0.1％甲酸；進樣量為4μL，自動進樣器溫度4℃；
質譜條件：①采用正離子模式進行檢測條件：以氮氣作為霧化、錐孔氣；飛行管檢測模
式V型，毛細管電壓4kV、錐孔電壓35kV、離子源溫度100℃；脫溶劑氣溫度350℃、反向錐孔氣
流50L/h、脫溶劑氣600L/h、萃取錐孔4V；②負離子模式條件：毛細管電壓3.5kV、錐孔電壓
50kV、離子源溫度100℃；脫溶劑氣溫度300℃、反向錐孔氣流50L/h、脫溶劑氣700L/h、萃取
錐孔4V；離子掃描時間0.03s、掃描時間間隔0.02s、數據采集范圍：50-1000m/z；
(4)通過MassProfiler軟件對L...

【專利技術屬性】
技術研發人員：輦偉奇，李麗仙，鄭曉東，易琳，張海偉，林昌海，劉興明，
申請(專利權)人：重慶市腫瘤研究所，
類型：發明
國別省市：重慶;85