本發(fā)明專利技術(shù)涉及具有增加微量元素含量的轉(zhuǎn)基因植物及其生產(chǎn)方法。具體地，所述轉(zhuǎn)基因植物并入編碼鐵調(diào)節(jié)蛋白1(IRP1/IMA1)或IRP1樣(IRL/IMA3)多肽的多核苷酸，其促將微量元素?cái)z取進(jìn)入植物。本發(fā)明專利技術(shù)還提供通過向有此需要的受試者施用含有所述的轉(zhuǎn)基因植物或其可食用組織或部分的組合物來治療微量元素缺乏的方法。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及。
技術(shù)介紹
微量元素營養(yǎng)，如鐵(Fe)、鋅(Zn)和錳(Μη)的缺乏，是一個(gè)普遍問題。已經(jīng)有若干 策略被用來解決這個(gè)問題，其中之一是遺傳修飾植物，其中所述微量營養(yǎng)元素增加。以這樣 的方式，攝食這些植物的受試者中的微量元素可得以改善。 盡管鐵(Fe)是地球上最豐富的元素之一，鐵缺乏癥是最普遍的人類群體的營養(yǎng)障 礙。膳食鐵的攝入量不足(特別是在鐵供應(yīng)主要或完全依賴于植物的地區(qū)）所造成的缺鐵性 貧血（IDA)影響全球超過十億人。通過施加鐵肥料增加在土壤中生物可利用鐵的水平是昂 貴的且不可持續(xù)的，并且不能針對所需植物部分。因此，提高鐵的獲取以及將其運(yùn)輸至可食 用植物部分是戰(zhàn)勝IDA所必須的。 植物演化了多方面的策略以從土壤中獲取鐵（1)。禾本科物種（Graminaceous species)在從麥根酸(mugineic acid)家族分泌通過T0M1以高親和性結(jié)合鐵的植物鐵載體 (phytosiderophores(PS))之后攝取鐵，隨后通過YSL轉(zhuǎn)運(yùn)子攝取(三價(jià)鐵)Fe-PS復(fù)合物。擬 南芥(Arabidopsis)和所有非草作物物種采用基于還原鐵的獲取策略，其中鐵首先由氧化 還原酶AtFR02進(jìn)行還原。亞鐵隨后由AtIRTI跨質(zhì)膜輸送（1，2)。這兩個(gè)鐵獲取策略過去被認(rèn) 為是相互排斥的(4)。但是，水稻(Oryza sativa)具有一個(gè)Fe2+的攝取系統(tǒng)(5)以及擬南芥分 泌鐵結(jié)合香豆素類似草類的PS-系統(tǒng)（6-8)，這表明這兩個(gè)鐵獲取策略可以包括共同的組 份。 在擬南芥中，bHLH型轉(zhuǎn)錄因子AtPYE和AtFIT控制參與鐵獲取和細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定的基因 的非重疊亞組OhAtFIT作為異源二聚體與lb亞組的bHLH轉(zhuǎn)錄因子AtbHLH038，AtbHLH039、 八七1^1^100和厶七詘1^101發(fā)揮作用（10，11)。在水稻（0巧23 83^￥3)0811?02中4讓乩!1100/ 101的直系同源物調(diào)節(jié)所述的Fe-PS轉(zhuǎn)運(yùn)子0sYSL15,但不經(jīng)由OsIRTl吸收Fe2+(12)。編碼 AtbHLH038/39/100/101和0sIR02的基因是鐵響應(yīng)的，提示為上游調(diào)控組件。與動物中相似， 在植物中感知鐵通過鐵與調(diào)節(jié)蛋白的直接結(jié)合發(fā)生，在水稻中為OsIDEFl/OsHRZs以及擬南 芥中為在 AtBTS(13，14)。 有必要來產(chǎn)生具有增加微量元素含量的轉(zhuǎn)基因植物，由此可以解決微量元素缺乏 的問題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
我們在此報(bào)告了一個(gè)新的肽家族，其在整個(gè)被子植物中許多高度多樣化的肽種共 享保守的短C末端氨基酸序列基序。我們叫這種肽序列IRON MAN(MA)，指的是其通過激活 鐵攝取的基因而啟動鐵和錳積累的能力。令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，IMA對于在植物中的鐵缺乏信號 傳遞是至關(guān)重要的，其作用在控制攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)和鐵的細(xì)胞穩(wěn)態(tài)級聯(lián)的早期，過表達(dá)IMA肽的 植物顯示一個(gè)或多個(gè)的微量元素，如鐵、鋅和/或錳水平的增加，這提高對動物的營養(yǎng)價(jià)值， 特別是在克服微量元素不足的問題上。還發(fā)現(xiàn)c-末端基序?qū)MA肽的功能是至關(guān)重要的，因 為重組IMA肽的C-末端基序刪除可以使功能完全消失。操縱頂A肽的表達(dá)代表了一種新的用 于作物中的鐵生物強(qiáng)化策略。 具體地，在第一方面，本專利技術(shù)提供使用重組多核苷酸轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物，所述重組 多核苷酸包含可操作連接至表達(dá)控制序列的編碼鐵調(diào)節(jié)多肽（即，如本文所用的MA肽）的 核苷酸序列， 其中鐵調(diào)節(jié)多肽包括C末端基序，所述C末端基序從N末端至C末端含有： ⑶DDD(SEQ ID N0:1)的第一結(jié)構(gòu)域，以及 DXAPAA(SEQIDN0:2)的第二結(jié)構(gòu)域， 其中第一結(jié)構(gòu)域和所述第二結(jié)構(gòu)域通過10個(gè)或更少氨基酸殘基的肽間隔連接， 其中，鐵調(diào)節(jié)多肽包括長度總計(jì)20至100的氨基酸殘基。 在一些實(shí)施方案中，鐵調(diào)節(jié)多肽提高植物中三價(jià)鐵還原活性或能激活植物中用于 鐵穩(wěn)態(tài)的一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，其選自AtbHLH38、AtbHLH39、AtFIT以及其任何組合。 在一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因植物過表達(dá)鐵調(diào)節(jié)多肽，且其微量元素含量高于對照 植物，其中微量元素選自鐵(Fe)、鋅(Zn)和錳(Μη)。 在一些實(shí)施方案中，所述鐵調(diào)節(jié)多肽包括長度總計(jì)20至90、25至85、或45至75的氨 基酸殘基。 在一些實(shí)施方案中，在所述鐵調(diào)節(jié)多肽的第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域之間的肽間隔 具有總計(jì)1至6個(gè)或1至3個(gè)任意的氨基酸殘基。 在一些實(shí)施方案中，所述C末端基序含有氨基酸序列，所述氨基酸序列選自SEQ ID 恥：3、4、5、6、7、8、9和10。 在一些實(shí)施方案中，所述鐵調(diào)節(jié)多肽含有氨基酸序列，所述氨基酸序列選自SEQ ID N0:25、26、27、63、65、74、75、98和99。 在第二方面，本專利技術(shù)提供如本文所述的轉(zhuǎn)基因植物的植物組織或部分或植物細(xì) 胞。 在第三方面，本專利技術(shù)提供用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包括(a)用含有編碼本文 所述鐵調(diào)節(jié)多肽的核苷酸序列的重組多核苷酸轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，以及(b)使在(a)中獲得的重 組植物細(xì)胞生長以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。 在第四方面，本專利技術(shù)提供了用于生物強(qiáng)化的方法，其包括在表達(dá)鐵調(diào)節(jié)多肽、足以 使轉(zhuǎn)基因植物中微量元素含量增加的條件下使本文所述的轉(zhuǎn)基因植物或其種子或其它繁 殖材料生長，其中所述微量元素選自鐵(Fe)、鋅(Zn)和錳(Μη)。 在第五方面，本專利技術(shù)提供由本文所述的轉(zhuǎn)基因植物、或其植物組織、植物部分或植 物細(xì)胞所制得的植物產(chǎn)品。本專利技術(shù)還提供含有所述植物產(chǎn)品的組合物，其可以是營養(yǎng)補(bǔ)充 劑或藥物組合物，其用于在有此需要的受試者中補(bǔ)充微量元素。 在第六方面，本專利技術(shù)提供了在受試者中補(bǔ)充微量元素的方法，其包括施用有效量 的如本文所述的轉(zhuǎn)基因植物、由其制得的植物產(chǎn)品或含有此植物產(chǎn)品的組合物組合物。 在一些實(shí)施方案中，本專利技術(shù)的方法有效地治療由微量元素缺乏所導(dǎo)致的癥狀或疾 病，包括缺鐵、缺鋅或缺錳。在一些特定的實(shí)施例中，微量元素缺乏是缺鐵，其導(dǎo)致貧血。 本專利技術(shù)的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案的細(xì)節(jié)詳見下文說明。從下文的若干實(shí)施方案的詳 述及從所附的權(quán)利要求中本專利技術(shù)的其它特征或優(yōu)點(diǎn)將將是顯而易見的。【附圖說明】 前面的概述以及本專利技術(shù)的以下詳細(xì)描述在結(jié)合附圖一起閱讀時(shí)將更好理解。為了 說明本專利技術(shù)的目的，在附圖中顯示的實(shí)施方案是目前優(yōu)選的。然而，應(yīng)該理解的是，本專利技術(shù) 并不限于所示的精確安排和設(shè)備。 在附圖中 圖1A至圖1B:顯示鑒定G-D-D-D-D-間隔-D-x-A-P-A-A序列基序。圖1A使用MEME組 件(24)鑒定的基序的序列標(biāo)識。圖1B圖表顯不序列基序的位置。 圖2A至圖2G顯示G-D-D-D-D-間隔-D-x-A-P-A-A基序?qū)τ陧擜肽的功能是至關(guān)重要 的。圖2A在35Spr 〇::MAlcDNA系中鐵的積累。AtMAl異位表達(dá)導(dǎo)致葉青銅化(左圖）。皮爾斯 染色顯示與野生型相比的高鐵濃度，特別是在葉脈中（中左）、根中柱（中右）、以及在胚芽中 (右圖）。圖2B在攜帶35Spr 〇: :MAlcDNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物中的過渡金屬濃度，擬南芥葉 (左)和種子(右）。圖2C胚芽的三價(jià)鐵還原活性。在三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中使用3批次30個(gè)胚芽來確 定還原活性。誤差棒表示平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖2D具有M本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包括：(a)用重組多核苷酸轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中所述重組多核苷酸包含可操作連接至表達(dá)控制序列的編碼鐵調(diào)節(jié)多肽的核苷酸序列，其中所述鐵調(diào)節(jié)多肽包括C末端基序，所述C末端基序從N末端至C末端含有：GDDDD(SEQ?ID?NO:1)的第一結(jié)構(gòu)域，以及DXAPAA?(SEQ?ID?NO:2)的第二結(jié)構(gòu)域，其中所述第一結(jié)構(gòu)域和所述第二結(jié)構(gòu)域通過10個(gè)或更少氨基酸殘基的肽間隔連接，其中所述鐵調(diào)節(jié)多肽包括共計(jì)長為20至100的氨基酸殘基，以及(b)使在(a)中獲得的重組植物細(xì)胞生長以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。
【技術(shù)特征摘要】
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【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：施臥虎，蘭平，盧毅，
申請(專利權(quán))人：中央研究院，
類型：發(fā)明
國別省市：中國臺灣;71
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