本發(fā)明專利技術(shù)為一種細(xì)胞膜電流抑制劑在抑制Kir2.1外向電流方面的應(yīng)用，該抑制劑的組成包括氫化肉桂酸和細(xì)胞浴液，其中，抑制劑中氫化肉桂酸的濃度為1～20mM；所述的細(xì)胞浴液的pH值為7.2～7.4，使用蔗糖調(diào)節(jié)其滲透壓為290～310mOsm/L；利用該混合物孵育表達(dá)有Kir2.1的突變體D172N和E299V通道蛋白的細(xì)胞，消除或有效抑制其外向電流。本發(fā)明專利技術(shù)通過研究得到的細(xì)胞膜電流抑制劑對Kir2.1單點(diǎn)突變體D172N和E299V的外向電流抑制率接近100%，半數(shù)有效抑制濃度分別為3.67mM和2.56mM。這為研制短QT3綜合癥靶向治療藥物打下很好的基礎(chǔ)。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于內(nèi)向整流鐘離子通道Kir2.1調(diào)節(jié)劑的篩選，具體設(shè)及氨化肉桂酸與 肥K293T細(xì)胞浴液混合物對Kir2. 1單點(diǎn)突變體D172N和E299V通道外向電流的抑制。
技術(shù)介紹
細(xì)胞膜上的離子通道蛋白具有通透某一種或者某幾種離子的功能，其種類繁多。 內(nèi)向整流鐘離子通道Kir2.1是一種只能通透鐘離子的孔道性蛋白。它只允許鐘離子內(nèi) 流而不允許鐘離子外流，因此其電流表現(xiàn)為內(nèi)向整流特性。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Kir2.1單點(diǎn)突變體 D172N或者E299V改變了Kir2. 1通道的內(nèi)向整流特性，它們引起了很強(qiáng)的外向電流。研究 發(fā)現(xiàn)正是運(yùn)一很強(qiáng)的外向電流引起了短QT3綜合征。運(yùn)種屯、臟疾病是一種家族病，會引起 嚴(yán)重的屯、臟性巧死，從嬰兒至毫?xí)兝先司邪l(fā)病表現(xiàn)。短QT綜合癥患者的屯、電圖中表現(xiàn)為 QT間期小于360ms，小于正常值360~440ms。運(yùn)是因?yàn)镈172N和E299V引起的外向電流會 加速屯、肌細(xì)胞復(fù)極化時間，進(jìn)而縮短QT間期，引起短QT3綜合癥。 迄今為止，治療短QT3綜合癥的主要方法是在人體內(nèi)植入除顫器。但是除顫器會 引起非常嚴(yán)重的神經(jīng)性損傷，對兒童及幼兒，根本無法利用除顫器進(jìn)行治療短QT3綜合征。 嬰幼兒患上了運(yùn)種疾病只有面臨死亡。但是藥物治療是解決運(yùn)一問題的很好途徑，可W通 過藥物來抑制D172N和E299V通道的外向電流來進(jìn)行治療運(yùn)種疾病。迄今為止，Kir2. 1外 向電流的抑制劑極度缺乏，所W尋找Kir2.1外向電流的抑制劑，就變得相當(dāng)迫切。 氨化肉桂酸是一種化合物單體，其常用于餅干、冰激凌和糖果等的增香劑。此外， 氨化肉桂酸作為中間體還常用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，可見其對人體副作用很小。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)所要解決的技術(shù)問題是針對當(dāng)前Kir2. 1內(nèi)向整流鐘離子通道電流抑制試 劑缺乏的情況下，提供一種細(xì)胞膜電流抑制劑，其組成包括氨化肉桂酸與細(xì)胞浴液。該抑制 劑能夠?qū)Ρ磉_(dá)于肥K293T細(xì)胞的Kir2. 1通道的突變體D172N或E299V的外向電流起到很 強(qiáng)的抑制作用。利用含有20mM氨化肉桂酸的細(xì)胞浴液混合物解育轉(zhuǎn)染D172N或E299V的 肥K293T細(xì)胞，則膜片錯記錄到的Kir2. 1的突變體D172N或E299V的外向電流消失。當(dāng)再 灌流無氨化肉桂酸的細(xì)胞浴液，則D172N或E299V通道電流得到恢復(fù)，運(yùn)說明氨化肉桂酸與 細(xì)胞浴液混合物未破壞Kir2.1通道蛋白的結(jié)構(gòu)。運(yùn)些實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了氨化肉桂酸與細(xì)胞 浴液的混合液對Kir2. 1通道外向電流起到抑制作用，為Kir2. 1突變體D172N和E299V外 向電流的抑制劑。 本專利技術(shù)的技術(shù)方案為： 陽007] -種細(xì)胞膜電流抑制劑，該抑制劑的組成包括氨化肉桂酸和細(xì)胞浴液，其中，抑制 劑中氨化肉桂酸的濃度為1~20mM;所述的細(xì)胞浴液的抑值為7. 2~7. 4,使用薦糖調(diào)節(jié) 其滲透壓為290~310m0sm/L。 陽OO引所述的細(xì)胞電流抑制劑在抑制Kir2.1外向電流方面的應(yīng)用，利用該抑制劑解育 表達(dá)有Kir2. 1的突變體D172N和E299V通道蛋白的細(xì)胞，消除或有效抑制其外向電流。 具體包括W下步驟： (1)配制細(xì)胞浴液； (2)將氨化肉桂酸加入到含有細(xì)胞浴液的離屯、管中，20~40攝氏度下超聲波振蕩 至固體全部溶解，得到氨化肉桂酸濃度為1~20mM的細(xì)胞浴液； (3)利用上面得到的細(xì)胞膜電流抑制劑解育表達(dá)有Kir2. 1單點(diǎn)突變體D172N或 E299V蛋白的肥K293T細(xì)胞，最終得到Kir2. 1單點(diǎn)突變體D172N或E299V外向電流被抑制 或消除的肥K293T細(xì)胞。 所述的細(xì)胞浴液優(yōu)選為細(xì)胞浴液a、細(xì)胞浴液b、細(xì)胞浴液C、細(xì)胞浴液d或者細(xì)胞 浴液e;其中， 所述的細(xì)胞浴液a的組成包括：116.88mM的KCl，5mM的MgClzJmM的邸TA, 2. 83mM 的皿2?〇4,7. 17mM的K2HPO4,溶劑為超純水，KOH調(diào)節(jié)溶液抑為7. 3,薦糖調(diào)節(jié)滲透壓為 290 ~310m0sm/L; 陽01引所述的細(xì)胞浴液b的組成或者包括：濃度分別為HOmM的KC1，IOmM的K-肥陽S，ImM的K-EGTA，溶劑為超純水，KOH調(diào)節(jié)溶液抑為7. 3,薦糖調(diào)節(jié)滲透壓為290~SlOmOsm/ L；所述的細(xì)胞浴液C的組成包括：濃度分別為1IOmM的KCl，IOmM的KH2PO4, 2mM的 邸TA, 5mM的肥陽S，1. 9mM的KzATP,溶劑為超純水，KOH調(diào)節(jié)溶液抑為7. 3,薦糖調(diào)節(jié)滲透 壓為 290 ~310m0sm/L; 所述的細(xì)胞浴液d的組成或者包括：濃度分別為123mM的KC1，5mM的 Kz邸TA, 7. 2mM的K2HPO4,SmM的KH2PO4,溶劑為超純水，KOH調(diào)節(jié)溶液抑為7. 3,薦糖調(diào)節(jié)滲 透壓為 290 ~310m0sm/L; 所述的細(xì)胞浴液e的組成包括：濃度分別為120mM的KC1，4mM的K2邸TA, 7. 2mM的 馬冊〇4,2.SmM的皿2?〇4,溶劑為超純水，KOH調(diào)節(jié)溶液抑為7. 3,薦糖調(diào)節(jié)滲透壓為290~ 310m0sm/L〇 本專利技術(shù)的有益效果是： 近十年，Kir2. 1通道內(nèi)向電流的抑制劑相繼被發(fā)現(xiàn)，比如ML133、他莫西芬、氯乙 基可樂定。但Kir2. 1突變體D172N和E299V產(chǎn)生外向電流的抑制劑還未見描述。而運(yùn)些 外向電流恰恰是短QT3綜合征發(fā)病的主要原因所在。所W尋找D172N和E299V外向電流的 抑制劑對已研究開發(fā)短QT3綜合征祀向治療藥物起著非常關(guān)鍵的作用。 本專利技術(shù)通過研究得到的細(xì)胞膜電流抑制劑對Kir2. 1單點(diǎn)突變體D172N和E299V 的外向電流抑制率接近100 %，半數(shù)有效抑制濃度分別為3. 67mM和2. 56mM。運(yùn)為研制短 QT3綜合癥的有效治療藥物打開了 一扇大n。而且氨化肉桂酸作為一種化合物單體，相對于 采用混合物與細(xì)胞浴液組成的抑制劑，其對人體副作用小，更加有利于祀向藥物進(jìn)一步的 研制?！靖綀D說明】 圖1為實(shí)施例1中，通過膜片錯內(nèi)向外模式記錄到的轉(zhuǎn)染Kir2. 1突變體Dl72N的 肥K293T細(xì)胞上的電流隨膜電位的變化，橫坐標(biāo)為電壓，縱坐標(biāo)為電流。其中： 圖1A，未灌流氨化肉桂酸的Kir2. 1突變體D172N電流特征曲線； 圖1B，20mM氨化肉桂酸和細(xì)胞浴液混合液灌流后的Kir2. 1突變體D172N的電流 變化曲線； 陽0巧]圖1C，利用細(xì)胞浴液沖掉含20mM氨化肉桂酸的細(xì)胞浴液后的Kir2. 1突變體D172N的電流變化。 陽0%] 圖2為實(shí)施例1中，含有20mM氨化肉桂酸的細(xì)胞浴液對D172N在+30mV時外向電 流的影響，其中HA表示氨化肉桂酸；圖3為實(shí)施例2中，含有不同摩爾濃度氨化肉桂酸的細(xì)胞浴液混合液對Kir2. 1 突變體D172N外向電流抑制百分比與混合物中氨化肉桂酸濃度的變化關(guān)系，也就是量效曲 線。橫坐標(biāo)為細(xì)胞浴液中含有氨化肉桂酸的摩爾濃度，縱坐標(biāo)為抑制Kir2. 1突變體D172N 外向電流的百分比。ICsc= 3. 67mM。 陽02引圖4為實(shí)施例3中，通過膜片錯內(nèi)向外模式記錄到的轉(zhuǎn)染Kir2. 1突變體E299V的 肥K293T細(xì)胞上的電流隨膜電位的變化，橫坐標(biāo)為細(xì)胞膜電壓，縱坐標(biāo)為通道電流。其中： 圖本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種細(xì)胞膜電流抑制劑在抑制Kir2.1外向電流方面的應(yīng)用，其特征為該抑制劑的組成包括氫化肉桂酸和細(xì)胞浴液，其中，抑制劑中氫化肉桂酸的濃度為1～20mM；所述的細(xì)胞浴液的pH值為7.2～7.4，使用蔗糖調(diào)節(jié)其滲透壓為290～310mOsm/L；應(yīng)用該抑制劑孵育表達(dá)有Kir2.1的突變體D172N和E299V通道蛋白的細(xì)胞，消除或有效抑制其外向電流。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：安海龍，任樹喜，展永，李軍委，柳輝，
申請(專利權(quán))人：河北工業(yè)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：天津;12
還沒有人留言評論。發(fā)表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。