本發明專利技術涉及一種泥螺寡肽在抗前列腺癌中的應用，尤其涉及該泥螺寡肽在抗前列腺癌DH-145腫瘤細胞藥物中的應用。該泥螺寡肽的氨基酸序列為Gln-Pro-Pro-Gly-Leu，以泥螺為原料，通過胰蛋白酶酶解泥螺組織，結合凝膠層析和高效液相色譜分離純化獲得。本發明專利技術中的泥螺寡糖可對前列腺癌DH-145腫瘤細胞顯著抑制，其中對DH-145細胞的增殖抑制率可達33.5～88.4％，對前列腺癌DH-145細胞的早期凋亡和晚期凋亡的影響率分別為20～22.27％和28～30.66％，可見具有顯著地抗腫瘤活性。泥螺寡肽具有良好的開發前景，對泥螺寡糖的抗前列腺癌DH-145腫瘤細胞的研究可為抗前列腺癌藥物的開發研究提供理論支持。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及泥螺酶解寡肽的應用，具體涉及一種泥螺寡肽在抗前列腺癌藥物中的 應用。
技術介紹
泥螺（Bullactaexarata)，俗稱"吐鐵"、"黃泥螺"、"梅螺"等，屬軟體動物門、腹足 綱、后鰓亞綱、頭楣目、阿地螺科、泥螺屬，為太平洋西岸海水及咸淡水特產的種類，由貝殼 和軟體兩部分組成，含有豐富的蛋白質、鈣、磷、鐵和維生素等成分，寡肽物質豐富，在我國 廣泛分布于東海和黃海兩側的長江，是一種常見的水產品。 惡性腫瘤是一類嚴重威脅人類健康和生命的疾病，發病率越來越高，目前已有的 化療藥物雖對大多數腫瘤有一定的療效，但選擇性差、毒副反應大、耐藥性等問題依然非常 明顯。因此，尋找高效、低毒、特異強的抗腫瘤藥物仍勢在必行。寡肽因其分子量小、無免疫 原性、活性高、副作用小，尤其是對多藥抗性的腫瘤細胞系也有很好的抑制活性。海洋生物 寡肽是目前海洋生物活性物質研究的一個重要領域，一些生物活性寡肽常以非活性狀態存 在于蛋白質中，這些蛋白質經過蛋白酶的水解作用，使得隱藏于其中的活性肽釋放出來，有 可能發揮出比蛋白質更多的生物活性。例如：如鄧偉等發現藻藍蛋白酶解寡肽對人宮頸癌 HeLa細胞株的體外生長有明顯的抑制作用；楊永芳等酶解紫貽貝所得的紫貽貝寡肽對前 列腺癌PC-3細胞和DU-145細胞有特異性的增殖抑制作用，并且對DU-145細胞的抑制作用 強于對PC-3細胞的增殖抑制作用；姚如永等研究泥蚶寡肽在0. 25-1. 0g·L1范圍內，寡肽 能明顯的抑制肺癌細胞A549和Ketr-3細胞的增殖，同時還能抑制細胞蛋白質的合成，并呈 明顯的劑量依賴性。 前列腺癌為男性高發的惡性腫瘤，其死亡率高居癌癥死亡率的第二位，僅次于肺 癌。近年來，隨著人們生活方式的改變、人口的老齡化以及診斷水平的不斷提升，我過前列 腺癌的發病率明顯呈上升趨勢。前列腺癌DU-145細胞是從前列腺癌腦轉移腫瘤中分離出 來的，分化程度低，為雄激素依賴的前列腺癌細胞，具有強大的轉移潛能，缺乏內源性的雄 激素受體的表達。DU-145細胞完全貼壁的時間通常為24h內，具有較強的侵襲和促血管新 生能力。研究泥螺酶解寡肽多前列腺癌DU-145細胞的抑制作用，對前列腺癌藥物的理論研 究具有重要意義。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題是在酶解泥螺組織獲取泥螺寡肽的基礎上，提供一種 泥螺寡肽在抗前列腺癌藥物中的應用，尤其是抗前列腺癌DU-145腫瘤細胞。 本專利技術解決上述技術問題所采用的技術方案為：一種泥螺寡肽在抗前列腺癌 DU-145細胞藥物中的應用，其特征在于：所述泥螺寡肽的氨基酸序列如SEQIDNO. 1所述， 其中藥物的具體實現形態可為片劑、膠囊劑、顆粒劑或丸劑等。 上述泥螺寡肽通過以下步驟制得：新鮮泥螺洗凈去殼，取泥螺組織搗碎勻漿，用鹽 酸溶液和氫氧化鈉溶液將勻漿液的pH值調節為8~9,料液比為1 : (3. 8~4)加入0. 4~ 0. 5 %勻漿液體積的胰蛋白酶，40~50°C保溫水解7~9h，水解完成后95~KKTC、10~ 15min進行滅酶，4°C下水解液于9500~10000r/min離心15~20min，取上清液，經3kd超 濾膜超濾獲得分子量小于3kd的第一組分，將該第一組分經凝膠層析洗脫獲得第二組分， 最后將該第二組分反相高效液相色譜分離獲得所述泥螺寡肽。 作為優選，所述凝膠層析條件如下：所述第一組分的濃度為48~50mg/mL、上樣 3~4mL、速度為2. 5~3. 5ml/min，流動相為超純水，280nm紫外檢測。 作為優選，所述反相高效液相條件如下：ZorbaxSB_C18(4. 6X250,5um);柱溫為 20°C;流動相為1 %TFA和乙腈；梯度洗脫：從開始到30min結束，乙腈濃度從0變化到40%， 洗脫速度為1. 〇mL/min;進樣體積為50ul紫外檢測波長分別為214nm、280nm。 進一步，6~14mg/ml所述泥螺寡肽作用于DU-145細胞24~36h后，對前列腺癌 DU-145細胞的增殖抑制率為33. 5~88. 4%，且增殖抑制率與泥螺寡肽的濃度呈正相關。 再進一步，6~14mg/ml所述泥螺寡肽作用于DU-145細胞24h后，對前列腺癌 H1299細胞的早期凋亡和晚期凋亡的影響率分別為20~22. 27%和28~30. 66%，且增殖 抑制率與泥螺寡肽的濃度呈正相關 與現有技術相比，本專利技術的優點在于：本專利技術利用泥螺為原料，通過酶解提取泥螺 寡肽，泥螺為一種低值貝類，在我國廣泛分布，來源廣，成本低，并且本專利技術中泥螺寡肽的提 取方法溫和易控，工藝簡單，操作方便。本專利技術中的泥螺寡糖可對前列腺癌DU-145腫瘤細 胞顯著抑制，其中對DU-145細胞的增殖抑制率可達33. 5~88. 4%，對前列腺癌DU-145細 胞的早期凋亡和晚期凋亡的影響率分別為20~22. 27%和28~30. 66%，可見具有顯著地 抗腫瘤活性。泥螺寡肽具有良好的開發前景，對泥螺寡糖的抗前列腺癌DU-145腫瘤細胞的 研究可為抗前列腺癌藥物的開發研究提供理論支持。【附圖說明】 圖1為實施例1中第一組分的凝膠層析圖譜； 圖2為實施例1中第二組分的高效液相色譜圖； 圖3為實施例4中泥螺寡肽對前列腺癌DU-145腫瘤細胞的增殖抑制作用與作用 時間和作用濃度關系折線圖； 圖4為圖3的柱狀圖； 圖5為實施例4中不同濃度的泥螺寡肽作用于與DU-145細胞后的HE染色圖，A: 對照組，B:6mg/ml，C: 10mg/ml，D: 14mg/ml; 圖6為實施例4中不同濃度的泥螺寡肽作用于與DU-145細胞后的Α0/ΕΒ雙染熒 光圖，A:對照組，B:6mg/ml，C: 10mg/ml，D: 14mg/ml; 圖7為實施例4中不同濃度的泥螺寡肽作用于與DU-145細胞后的Annexin V-FITC/PI染色結果圖，A-1:對照組，A_2:6mg/ml，A_3:10mg/ml，A_4:14mg/ml。【具體實施方式】 以下結合附圖實施例對本專利技術作進一步詳細描述。 實施例1 :泥螺寡肽的制備 (1. 1)原料處理：取新鮮泥螺，將泥螺去殼、浙干后勻漿備用。 (1. 2)泥螺酶解工藝 用高速組織搗碎機將泥螺組織搗碎勻漿，精密稱取勻漿液，用0.lmol/L的鹽酸 溶液和〇.lmol/L的NaOH溶液調pH值，加入胰蛋白酶酶解數小時，酶解條件為酶解溫度 45°C，pH為8. 7,料液比1:4,酶解時間8h，加酶量0. 48%。100°C下滅酶15min，4°C下離心 15min(10000r/min)，取上清液濃縮備用。 (1. 3)泥螺多肽的分離純化 首先選用超濾法對泥螺多肽酶解液進行分離，超濾膜分別選用10kd，5kd，3kd，分 別截留到分子量l〇-5kd、5-3kd和小于3kd三個組分，冷凍干燥后分別配成20mg/mL的濃 度，用MTT法測定各個組分對前列腺癌DU-145的抑制率。選出活性最高的第一組分（分子 量小于3kd)，選用SephadexG-25凝膠層析，裝柱后用去離子水平衡，濃度為50mg/mL、上樣 4mL、速度為3ml/min，流動相為超純水，280nm紫外檢測，凝膠層析曲線如圖1所示，收集最 高洗脫峰冷凍干燥成粉本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種泥螺寡肽在抗前列腺癌DU?145細胞藥物中的應用。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：聞正順，馬劍茵，曹玉昊，林煥樂，胡俊峰，
申請(專利權)人：浙江海洋學院，
類型：發明
國別省市：浙江;33
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