哺乳動物的環二核苷酸信號通路的藥物靶向制造技術

環-GMP-AMP合酶(cGAS)和包括2'3-cGAMP、2'2-cGAMP、3'2'-cGAMP和3'3'-GAMP的環-GMP-AMP(cGAMP)用于藥物制劑(包括疫苗佐劑)、藥物篩選、療法和診斷。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】【專利說明】晡乳動物的環二核苷酸信號通路的藥物靶向 本專利技術在由美國國立衛生研究院（NIH)提供的基金編號ROI AI-093967的政府支 持下進行。政府對本專利技術具有一定的權利。
技術介紹
細胞質的DNA誘導I型干擾素和其它的細胞因子，其對于抗微生物防御是重要的， 但也可導致自身免疫。此DNA信號通路需要銜接蛋白STING和轉錄因子IRF3,但DNA傳感 (DNA sensing)的機制尚不清楚。本文中，本專利技術人報道了在存在DNA而沒有RNA的情況 下，哺乳動物細胞質提取物在體外從ATP和GTP合成了環GMP-AMP (cGAMP)。哺乳動物細胞 的DNA轉染或DNA病毒感染也觸發cGAMP的產生。cGAMP結合STING，導致激活IRF3并誘 導干擾素0 (IFNP)。因此，cGAMP代表了后生動物中的第一環二核苷酸，并且其作為響應 細胞質DNA而觸發干擾素產生的內源第二信使起作用。 通過生化分級和定量質譜，本專利技術人還確定了 cGAMP合酶（cGAS)，其屬于核苷酸 轉移酶家族。cGAS的過表達激活轉錄因子IRF3并以STING-依賴的方式誘導IFNP。敲除 cGAS抑制了經DNA轉染或DNA病毒感染的IRF3激活和IFNI3誘導。cGAS在細胞質中結 合DNA并催化cGAMP合成。這些結果表明，cGAS是胞質DNA傳感器，其通過產生第二信使 cGAMP誘導干擾素。 本專利技術將這些發現應用于涉及環-GMP-AMP合酶（cGAS)和環-GMP-AMP (cGAMP)的 新方法和組合物，包括其在制劑（包括疫苗佐劑）、藥物篩選、治療方法和診斷中的用途。
技術實現思路
在一個方面中，本專利技術提供了基于細胞的藥物篩選，這包括抑制cGAS的方法，其 包括將細胞或細胞提取物與有效量的外源性cGAS抑制劑相接觸，并檢測所獲得的合酶抑 制。在具體的實施方式中，通過環-GMP-AMP誘導的IRF3激活（二聚化或核轉位）、干擾素 產生或NF-kB激活來推理檢測所獲得的抑制。 在另一個方面中，本專利技術提供了治療方法，這包括抑制cGAS的方法，其包括將確 定的有需求的細胞與有效量的外源cGAS抑制劑相接觸。在具體的實施方式中，方法包括向 確定的有需求且包含所述細胞的哺乳動物施用抑制劑，和/或抑制劑是小分子環化酶抑制 劑或是cGAS特異性shRNA或siRNA。 在另一個方面中，本專利技術提供了體外藥物篩選，這包括抑制cGAS的方法，其包括 將包含合酶、ATP、GTP的混合物與抑制劑在條件下相接觸，其中所述條件下抑制劑抑制了經 合酶的ATP和GTP到環-GMP-AMP和無機焦磷酸的催化轉化，并檢測所獲得的合酶抑制。在 一個具體的實施方式中，混合物進一步包括DNA并且轉化是DNA-依賴性的。在其它的實施 方式中，cGAS是組成型活性的。 在另一個方面中，本專利技術提供了體外藥物結合測定，這包括抑制cGAS結合到底物 或輔因子的方法，其包括將包含合酶和ATP或GTP的底物或DNA輔因子的混合物與抑制劑 在條件下相接觸，其中所述條件下抑制劑抑制了合酶到底物或輔因子的結合，并檢測所獲 得的結合抑制。 在另一個方面中，本專利技術提供了制備cGAMP的方法，所述方法包括在條件下形成 包含cGAS、ATP和GTP的混合物，其中所述條件下合酶催化轉換ATP和GTP到cGAMP，其中 合酶、ATP和GTP是預定義量的，或者方法進一步包括分離或檢測所獲得的cGAMP的步驟。 在【具體實施方式】中，混合物進一步包括DNA并且轉化是DNA-依賴性的。 在另一個方面中，本專利技術提供了檢測cGAMP水平、cGAS水平或cGAS突變的方法， 所述方法包括以下步驟：檢測來自人的樣品中的cGAMP水平、cGAS水平或cGAS突變，并基 于cGAMP水平、cGAS水平或cGAS突變將所述的人分配一個自身免疫性疾病度量；和任選地 向所述的人施用用于自身免疫性疾病的治療方法。 在另一個方面中，本專利技術提供了包含預定量的cGAMP的組合物，如進一步包含針 對靶病原體的免疫原的疫苗，其中cGAMP提供了佐劑。在【具體實施方式】中，組合物不含其它 的環二核苷酸，和/或另外地，適合于作為佐劑或疫苗，例如無菌的，藥學上可接受的，以確 定的、預定的量、比率等，并且組合物可以是為單個使用量化的散裝或單位劑量。本專利技術還 提供了誘導或促進免疫應答的方法，包括向有需求的哺乳動物施用有效量的此類組合物。 在【具體實施方式】中，給藥是粘膜（舌下或鼻內）、肌內或皮下給藥。 本專利技術包括所列【具體實施方式】的所有組合。進一步的實施方式和本專利技術的適用性 的全部范圍將因下文所給出的詳細描述而變得顯而易見。然而，應當理解的是，詳細描述和 具體實施例雖然表示了本專利技術的優選實施方式，但僅以說明的方式給出，這是因為本專利技術 的精神和范圍內的各種變化和修改因這一詳細描述而對于本領域技術人員而言變得顯而 易見。【具體實施方式】 本專利技術提供了涉及cGAS和cGAMP的方法和組合物，這包括其在制劑（包括疫苗佐 劑）、藥物篩選、治療方法和診斷中的用途。 要點：2' 3' -cGAMP是哺乳動物細胞所產生的內源性第二信使；2' 3' -cGAMP是 STING的高親和配體；2' 3' -cGAMP是I型干擾素的強誘導物；2' 3' -cGAMP結合誘導了 STING 的構象變化。 在一個方面中，本專利技術提供了基于細胞的藥物篩選，這包括抑制cGAS的方法，藥 物篩選包括將細胞或細胞提取物與有效量的外源性cGAS抑制劑相接觸，并檢測所獲得的 合酶抑制。合酶通常地是人或鼠cGAS，并且可以在融合蛋白中被截斷、重組，或進行其它修 改以適合分析。通常，方法是作為篩選分析進行的，其中抑制劑是用于分析的候選抑制劑， 其可能來自文庫、先導化合物優化等。例如通過cGAMP誘導的IRF3激活（二聚化或核轉 位）、干擾素產生或NF-kB激活直接或推理檢測抑制，通過例如質譜、基于抗體的分析（例 如，ELISA、ALPHA、熒光偏振等）直接檢測cGAMP和其它產物。例如，可以通過q-RT-PCR測 量IFN RNA，通過非變性凝膠電泳測量IRF3二聚化。另外的合適的讀取包括ATP、GTP和焦 磷酸（PPi)的測量。 在另一個方面中，本專利技術提供了治療方法，這包括抑制cGAS的方法，治療方法包 括將確定的有需求的細胞與有效量的外源cGAS抑制劑相接觸。在具體的實施方式中，方法 包括向確定的有需求且包含所述細胞的哺乳動物施用抑制劑，和/或抑制劑是小分子環化 酶抑制劑，或是cGAS特異性shRNA或siRNA，或其它的RNAi或反義RNA cGAS特異性抑制 劑。 本專利技術人的數據表明，cGAS和cGAS-cGAMP途徑對于觸發針對自身和外源DNA的炎 癥反應是重要的，因此cGAS抑制劑可用于降低相關自身免疫性疾病的病原性cGAS活性。類 似地，本專利技術人的數據表明，cGAS對于從正常細胞到癌細胞的轉化也是重要的，并且對于癌 細胞的生存和轉移也是重要的，因此cGAS抑制劑可用于降低相關的腫瘤性（neoplastic) 疾病的病原性cGAS活性。目前用于狼瘡和其它自身免疫性疾病的治療方法涉及大劑量的免疫抑制劑，其具 有嚴重的副作用。雖然一種新的BAFF抗體（Benly本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種包含預定量的環?GMP?AMP(cGAMP)的組合物。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：志建·陳，麗君·孫，嘉西·吳，和平·史，綽·陳，
申請(專利權)人：得克薩斯州立大學董事會，
類型：發明
國別省市：美國;US