本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）鑒別檢測試劑盒及其應(yīng)用。該試劑盒包含一對PRRSV特異性檢測引物和檢測體系。經(jīng)檢測驗(yàn)證，試劑盒能快速、方便、高效、高特異、高靈敏地檢測PRRSV，并且應(yīng)用一組引物即可區(qū)分出PRRSV?TJM-F92株、美洲型經(jīng)典株和變異株（高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒），其試劑成本低，操作便捷，適用于進(jìn)出口檢疫、專業(yè)實(shí)驗(yàn)室等對PRRSV的鑒定。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于動物病毒分子生物學(xué)檢測
，涉及一種鑒別診斷PRRSVTJM-F92株、美洲型經(jīng)典株和變異株的引物及試劑盒及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
豬繁殖與呼吸道綜合征（Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome， PRRS)俗稱"豬藍(lán)耳病"，是由PRRSV(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome virUS，PRRSV)引起的一種以懷孕母豬繁殖障礙和仔豬呼吸道癥狀為特征的傳染病，是目前 引起豬場繁殖障礙的主要疫病之一。該病首先暴發(fā)于美國，隨后傳播到世界各地，給世界養(yǎng) 豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在中國，郭寶清等于1996年首次從北京地區(qū)暴發(fā)流行的流產(chǎn)胎 兒體內(nèi)分離到PRRSV，從而證實(shí)了該病在我國的存在。 近年來，PRRSV在國內(nèi)的流行過程中不斷演化重組，新流行毒株越來越多，這些變 化帶來的是病毒防控的難度持續(xù)增加與致病力的持續(xù)增強(qiáng)。經(jīng)過近20年的進(jìn)化，使得目前 國內(nèi)流行毒株已經(jīng)不單單是美洲型PRRSV經(jīng)典株。2006年發(fā)生于我國的高致病性PRRS， 造成國內(nèi)大量高致病性PRRSV的流行毒株(變異株）出現(xiàn)，該類型毒株大部分NSP2基因缺 失90個(gè)堿基，目前已經(jīng)占據(jù)了國內(nèi)分離毒株的70%以上，而且其自身還在繼續(xù)變異。同 時(shí)，不同來源的PRRSV基因的重組導(dǎo)致大量新毒株和中間毒株產(chǎn)生，包括野毒間的重組毒 株、疫苗毒株和野毒株的重組毒株、以及疫苗毒株演化而來的毒株，最終導(dǎo)致PRRSV新毒株 層出不窮。 由于PRRSV病毒分離培養(yǎng)方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，目前已經(jīng)報(bào)道的PCR方法只能區(qū)分1-2 種類型的PRRSV。為更準(zhǔn)確地開展病原學(xué)調(diào)查和研宄，獲取更多的病原信息，研宄開發(fā)可以 快速、準(zhǔn)確鑒別PRRSV經(jīng)典毒株與不同類型變異毒株的RT-PCR檢測方法勢在必行。 迄今，關(guān)于PRRSV的檢測，已有專利技術(shù)公開發(fā)布，但這些技術(shù)和本專利申請的內(nèi) 容存在較大的區(qū)別。簡要情況如下： (1)中國專利申請?zhí)枮?00710076592. 5,公開了一種用于檢測高致病性PRRSV核苷酸 片段的引物和探針序列，序列為： 上游引物PVpf: 5 ' -CCCAAGCTGATGACACCTTT-3 ' 下游引物PVpr: 5 ' -AATCCAGAGGCTCATCCTGGT-3 ' 探針PVpb: 5 ' -CGCGTAGAACTGTGACAACAACGCTGA-3 ' 該方法使用熒光定量PCR方法可檢測樣品中是否含有高致病性PRRSV，但無法檢測是 否含有經(jīng)典株。 (2)中國專利申請?zhí)枮?00810032141. 6,公布了一種高致病性PRRSVRT-PCR快速 檢測試劑盒，引物序列為： PrimerPl:5' -CGTAGAACTGTGACAACAAC-3' PrimerP2 :5' -TGAGTATTTTGGGCGTGTGAT-3' 該方法使用一步法PCR方法可檢測樣品中是否含有高致病性PRRSV，無法判斷是否含 有PRRSV經(jīng)典株。 (3)中國專利申請?zhí)枮?00910077704. 8公開了PRRSV經(jīng)典株和變異株雙重實(shí)時(shí)熒 光RT-PCR鑒別檢測方法。 檢測PRRS經(jīng)典株的引物和探針為： 上游引物PRRSV-F2 :5' -CGCACCAGATGGRACCTACTT-3' 下游引物PRRSV-R3 :5' -ACGGTGITCAGTGAGGGCTIT-3' 探針PRRSV-P: 5'-CCAGTCAACGCAGCG-3' 檢測PRRS經(jīng)典株的引物和探針為： 上游引物H-PRRSV-F2 :5' -AGTGGGTCGGCACCAGIT-3' 下游引物H-PRRSV-R12 :5' -GCAGACAAATCCAGAGGCTCAT-3' 探針H-PRRSV-P: 5' -CGTAGAACTGTGACAAC-3' 該方法可以一次反應(yīng)鑒別PRRSV經(jīng)典株和變異株，但無法區(qū)分樣品中是否含有PRRSVTJM-F92 株。 (4)中國專利申請?zhí)?01310189880. 7公開了檢測豬藍(lán)耳病流行病毒與HP-PRRS病 毒天津株的RT-PCR試劑盒。引物序列為： 上游引物Pa:5' -CGTCCGTGTCATCAAGCAGCTC-3' 下游引物Pc:5, -AAAAGAGGCACAATAGAGTAAAAGG-3， 該方法一次反應(yīng)就能檢測樣本中是否含有該致病性PRRSV天津株（TJ株)和PRRSV流行 病毒(包括高致病性PRRSV江西株、湖南株和PRRSV經(jīng)典株)，但該方法不能進(jìn)一步將PRRSV 變異株(包括高致病性PRRSV江西株、湖南株及其相似毒株）和PRRSV經(jīng)典株加以鑒別。 綜上所述，上述四種專利方法均不能經(jīng)過一次反應(yīng)同時(shí)檢測樣本中是否含有 PRRSV經(jīng)典毒株、TJM-F92株和其它高致病性豬繁殖與變異株，并將三者進(jìn)行鑒別。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)公開了一種PRRSV鑒別檢測試劑盒，該試劑盒的引物不同于與上述公布的 四個(gè)專利，只需一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)就可同時(shí)檢測出樣本中是否含有PRRSVTJM-F92、經(jīng)典株和 變異株(包括高致病性藍(lán)耳病病毒)，其試劑成本低，操作便捷，實(shí)用性強(qiáng)，適合于基層和專 業(yè)實(shí)驗(yàn)室對病毒株的快速鑒定。 因此，本專利技術(shù)提供了一種用于美洲型PRRSVTJM-F92株、經(jīng)典株和變異株的鑒別 特異性引物組，它包括： PRRS-F5' -TTCCTGCACCGCGTAGAACTGTG-3' SEQIDNO：1 PRRS-R5' -CTATTTTCCCGAGGATGCGTGGA-3' SEQIDNO：2 本專利技術(shù)更進(jìn)一步公開了采用美洲型PRRSVTJM-F92株、經(jīng)典株和變異株(包括高致病 性藍(lán)耳病病毒）的鑒別檢測的特異性引物組制成的試劑盒，其特征在于它的組成如下： (1) PCR反應(yīng)液（PBbuffer) 700yL PCR反應(yīng)液中含有：10XPCR(Mg2+Plus)buffer2.5yL，dNTPs(2.5mM) 2.0yL，PRRS-F(100pmol/yL) 1. 0yL,PRRS-R(100pmol/yL) 1. 0yL (2) 超純水 1.5mL (3) 七&9酶（5。/1^)60卩1 (4)其中的引物指的是： PRRS-F 5' -TTCCTGCACCGCGTAGAACTGTG-3' SEQIDNO：1 PRRS-R 5' -CTATTTTCCCGAGGATGCGTGGA-3' SEQIDNO：2 本專利技術(shù)更進(jìn)一步公開了用于檢測PRRSV的鑒別檢測試劑盒的使用方法，包括下述步 驟： (1)擴(kuò)增反應(yīng)體系：擴(kuò)增反應(yīng)的總體積為25yL，其各種成分及終濃度分別為：PCR反應(yīng) 液（PBbuffer) 6.5yL，taq酶（5U/yL)0.5yL，待檢樣品cDNA 3~7yL，超純水11~ 15 u L〇 (2)擴(kuò)增反應(yīng)過程：94°C預(yù)變性5 min ;94°C 30 s，59°C 30 s，72°C 30 min，進(jìn)行 30個(gè)循環(huán)；72°C延伸10 min，4°C結(jié)束反應(yīng)。 (3)擴(kuò)增產(chǎn)物檢測：擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束，取擴(kuò)增產(chǎn)物5當(dāng)前第1頁1 2 本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種用于豬繁殖與呼吸綜合征病毒鑒別的特異性引物，其特征在于它是由下述引物組成：PRRS?F??????TTCCTGCACCGCGTAGAACTGTG???????SEQ?ID?NO：1PRRS?R?????CTATTTTCCCGAGGATGCGTGGA???????SEQ?ID?NO：2?。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：周緒斌，鄢明華，萬春燕，孫英峰，黎作華，王利麗，張莉，李秀麗，路超，
申請(專利權(quán))人：新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司，天津市畜牧獸醫(yī)研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：新疆;65
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