本發明專利技術公開了一種用于擴增甲酸脫氫酶的引物對。本發明專利技術還公開了一種外源表達甲酸脫氫酶的重組菌。本發明專利技術還公開了一種外源表達甲酸脫氫酶的重組菌的構建方法。本發明專利技術還公開了一種外源表達甲酸脫氫酶的重組菌在制備R,R-2，3-丁二醇方面的應用。本發明專利技術的Paenibacillus?polymyxa?ZJ-9，通過NBS?7.5L發酵罐發酵結果顯示，DCW提高了3.9%，達到23.1g/L，R,R-2,3-丁二醇產量提高了10.2%，達到36.8g/L，副產物甲酸含量由3.3g/L降低為0.9g/L。副產物甲酸含量的降低，有利于后期發酵液的分離純化，為R,R-2,3-BD工業化打下基礎。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物化工
，具體涉及一種外源表達甲酸脫氫酶的重組菌及其 應用。
技術介紹
2, 3-丁二醇是一種重要的化工原料和液體燃料，廣泛應用于化工、食品、燃料及 航空航天等領域，具有生物降解性。2, 3- 丁二醇含有兩個手性碳原子，因此具有三種旋光 異構體（分別為R，R-2, 3- 丁二醇、S,S-2, 3- 丁二醇和mes〇-2, 3- 丁二醇）。R,R-2, 3- 丁 二醇除了具有上述用途以外，還是優良的抗凍劑，也是合成手性試劑、手性配體的重要中 間體，在手性藥物和天然產物的合成中也有潛在的重要應用。目前，研宄發現能夠代謝合 成R，R-2,3-丁二醇的微生物寥寥無幾，而多粘類芽孢桿菌（Paenibacilluspolymyxa， 前稱Bacilluspolymyxa)是其中唯一具備工業化生產R,R-2, 3-丁二醇潛力的微生物。 P.polymyxa中的極少數菌株能夠產菊粉酶，可以直接利用能源植物菊芋菊粉（菊糖）一步 法發酵制備高附加值的R，R-2, 3- 丁二醇。其中輔酶NADH作為還原當量起著關鍵的作用， 其含量的高低直接影響到2, 3- 丁二醇的產量，這些NADH主要是由菊粉氧化途徑合成再生 的。因此，適當提高胞內NADH濃度及NADH/NAD比例，有望提高2, 3- 丁二醇合成濃度。 由于輔酶NADH結構復雜、不穩定和價格昂貴等缺點，在工業生產中不斷添加輔酶 NADH顯然是不可行的，因而輔酶NADH的再生就成為降低生產成本的重要環節。近年來，甲 酸脫氫酶（FDH)輔酶再生系統引起了人們的廣泛關注，并成功應用于L-叔亮氨酸的工業生 產。甲酸脫氫酶屬于D-2-羥基酸脫氫酶類，廣泛存在于甲醇利用型的細菌和酵母中。它可 以在催化甲酸轉化為二氧化碳的同時將NAD+還原成NADH。本專利技術選擇Candidaboidinii 作為分子生物學操作的出發菌株，通過PCR技術從該菌株的基因組上擴增得到了甲酸脫氫 酶的編碼基因（fdh基因），PaenibacilluspolymyxaZJ-9作為宿主，成功構建了能夠高效 表達甲酸脫氫酶的重組菌，提高了R，R_2, 3-丁二醇的產量，減少了副產物甲酸的含量，有 良好的工業應用前景。
技術實現思路
專利技術目的：本專利技術的第一個目的是提供一種用于擴增甲酸脫氫酶的引物對。 本專利技術的第二個目的是提供一種外源表達甲酸脫氫酶的重組菌。 本專利技術的第三個目的是提供一種外源表達甲酸脫氫酶的重組菌的構建方法。 本專利技術的第四個目的是提供表達一種外源表達甲酸脫氫酶的重組菌在制備 R，R-2, 3- 丁二醇方面的應用。本專利技術的第五個目的是提供一種R，R-2, 3- 丁二醇的生產方 法。 技術方案：為了解決上述技術問題，本專利技術所采用的技術方案為：一種用于擴增 甲酸脫氫酶的引物對，所述引物對包括兩組：第一組引物對如下：F1 ：5r -AGGCCGGGGCATATGGGAAACA-3rR1 ： 5r -TAAGACTAAAACGATCTTCATAAGCTTCTGTTATTAATTCTT-3r 第二組引物對如下： F2 ： 5r -AAGAATTAATAACAGAAGCTTATGAAGATCGTTTTAGTCTTA-3rR2W-CCGGGATCCTTATTTCTTATCGTGTTTACC-3^ 。 一種外源表達甲酸脫氫酶的重組菌，它是以B.subtilis168基因組為模板以第 一組引物對進行PCR擴增得到獲得的P43啟動子片段，以假絲酵母Candidaboidinii的 基因組為模板以第二組引物對PCR擴增得到甲酸脫氫酶基因片段fdh，再將獲得的P43啟 動子片段與甲酸脫氫酶基因片段進行重疊PCR，將重疊PCR獲得的產物與質粒pMA5在T4 連接酶作用下連接得到重組質粒pMA5-P43-fdh，最后將重組質粒pMA5-P43-fdh電轉入 P.polymyxaZJ-9 中獲得重組菌P.polymyxaGX-1。 一種外源表達甲酸脫氫酶的重組菌的構建方法，包括以下步驟： 1)以B.subtilis168基因組為模板設計第一組引物對，如上述序列所示，PCR擴 增得到P43強啟動子片段，切膠回收備用； 2)以假絲酵母Candidaboidinii的基因組為模板，設計第二組引物對，如上述序 列所示，PCR擴增得到甲酸脫氫酶基因片段fdh; 3)將獲得的P43強啟動子片段與甲酸脫氫酶基因fdh進行重疊PCR; 4)經限制性內切酶BamHI和NdeI雙酶切，與經過同樣雙酶切的質粒pMA5在T4 連接酶的作用下進行連接得到重組質粒pMA5-P43-fdh; 5)將重組質粒pMA5-P43_fdh電轉入P.polymyxaZJ-9,獲得重組菌P.polymyxa GX-l〇 一種外源表達甲酸脫氫酶的重組菌在制備R，R_2,3-丁二醇方面的應用。 -種R，R_2, 3-丁二醇的生產方法，以上述的重組菌P.polymyxaGX-1在發酵罐中 發酵獲得。 其中，上述發酵培養條件為：溫度30°C，通氣量lvvm，裝液量4L，接種量8%，前 22h轉速為300r/min，后22h調為200r/min，pH調控策略為：發酵初期不控發酵液pH，待發 酵過程中隨著pH值降到6. 0以下時，用4MNaOH調pH為6. 0。 其中，上述發酵過程中活化培養基：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，NaCl5g/L，瓊脂 10 ~20g/L，pH7. 0 ;種子培養基：菊粉 20g/L，蛋白胨 10g/L，酵母膏 3g/L，NaC15g/L，pH 7. 0 ;發酵培養基：菊粉 75g/L，酵母膏 6g/L，蛋白胨 2g/L，MgS04 ? 7H200. 5g/L，K2HP043.09g/ L，MnS04 ?H20 0? 001g/L，NH4C1 0? 93g/L，FeS04 ? 7H20 0? 04g/L，ZnS04 ? 7H20 0? 001g/L，pH 6. 0〇 有益效果：與現有技術相比，本專利技術的優點是：本專利技術通過將外源甲酸脫氫酶導 入P.polymyxaZJ-9中，實現該菌株的輔酶再生，最終提高R，R-2, 3-丁二醇的產量，減少副 產物甲酸的含量，有利于產物的提取分離，該方法操作簡單，環境友好，重組菌適合大規模 的工業化生產。本專利技術的PaenibacilluspolymyxaZJ-9,通過NBS7. 5L發酵罐發酵結果 顯示，001提高了3.9%，達到23.18/1，民1?-2,3-丁二醇產量提高了10.2%，達到36.8 8/1， 副產物甲酸含量由3. 3g/L降低為0. 9g/L。副產物甲酸含量的降低，有利于后期發酵液的分 離純化，為R，R-2, 3-BD工業化打下基礎。【附圖說明】 圖1P43,fdh基因片段膠回收后電泳圖； 圖2重疊PCR擴增的P43_fdh片段電泳圖； 圖3重組質粒構建流程圖； 圖4重組菌P.polymyxaGX-1的驗證電泳圖。【具體實施方式】 下面通過具體的實施例對本專利技術進一步說明，應當指出，對于本領域的普通技術 人員來說，在不脫離本專利技術原理的前提下，還可以做出若干變型和改進，這些也應視為屬于 本專利技術的保護范圍。 實施例1 :基因組DNA的提取 用GenomicDNAP本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種用于擴增甲酸脫氫酶的引物對，其特征在于，所述引物對包括兩組：第一組引物對如下：F1：5′?AGGCCGGGGCATATGGGAAACA?3′R15′?TAAGACTAAAACGATCTTCATAAGCTTCTGTTATTAATTCTT?3′第二組引物對如下：F2：5′?AAGAATTAATAACAGAAGCTTATGAAGATCGTTTTAGTCTTA?3′R2：5′?CCGGGATCCTTATTTCTTATCGTGTTTACC?3′。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：高健，徐尤勇，彭斌，張紅，薛鋒，彭英云，丁鴿，李鳳偉，
申請(專利權)人：鹽城工學院，
類型：發明
國別省市：江蘇;32
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