修飾的APOL1多肽制造技術

本發明專利技術提供了修飾的ApoL1多肽，具體地，在細菌細胞中表達不具有N-末端或f-甲硫氨酸的修飾多肽。還提供了重組生產所述修飾多肽的方法。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】【專利說明】修飾的AP0L1多化 專利
本專利技術提供了修飾的Apo-Ll蛋白。具體地，本專利技術提供了純化的蛋白、核酸，W及 重組表達該些修飾蛋白的方法。[000引專利技術背景 蛋白在遺傳改變的原核細胞中的生物合成導致具有連接至氨基末端的N-甲酯-或末 端甲硫氨酸的蛋白的表達。由于向天然蛋白添加N-甲酯甲硫氨酸可改變其生物活性、構象 穩定性、抗原性等，在可能的情況下，最期望將其除去。 在大腸桿菌（公.co7i)中的蛋白合成通常起始于修飾的氨基酸N-甲酯甲硫氨酸 (fMet)，因此，fMet是大多數蛋白中的N-末端氨基酸。除了極少數例外，N-甲酯基團隨后 通過膚去甲酯酶去除，并且依賴于第二個氨基酸的身份，還通過甲硫氨酸氨膚酶（MA巧切 除N-末端甲硫氨酸。特別地，在強過表達的重組蛋白中，fMet去甲酯化可變得不完全，并 且由于fMet是免疫原性的，該會對用于制藥目的的蛋白造成問題。 載脂蛋白心1 (Ap化1)是人特異性血清蛋白，其通過在寄生蟲的內體膜中形 成離子孔殺死布氏錐蟲（化巧><3/7(95〇?<3知ucei)。布氏錐蟲羅德西亞亞種化知ucei subspeciesrAo沁siense)和岡比亞亞種（r.知化?eisubspecies腳曲如抵抗該種裂 解活性，并且能夠感染人類，導致昏睡癥。在布氏錐蟲羅德西亞亞種的情況下，對裂解的抗 性設及血清抗性相關（SRA)蛋白與ApoLl的C-末端螺旋的相互作用。正常的人血清（N服） 能夠殺死布氏錐蟲指名亞種（7： 知ucei)，但不能殺死布氏錐蟲羅德西亞亞種和布氏錐 蟲岡比亞亞種。 在其分泌前導膚的加工后，人ApoLl具有N-末端氨基酸序列Glu-Glu-Ala-Gly-。 在大腸桿菌中過表達時，由于在第二氨基酸位置的大且帶電的谷氨酸，ApoLl保留了在 N-末端的Met(和可能殘留的fMet)。 為了在完全去除fMet之外還保持ApoLl的高表達率，需要將膚酶引入宿主細胞系 之外的其他技術。本專利技術通過提供修飾的ApoLl蛋白而滿足了該種需求，所述修飾的Ap化1 蛋白在表達時，缺少末端f-Met，同時保持高表達水平。 附圖簡述 圖1顯示了W下的5個N-末端氨基酸的序列分析；（圖1A)Ap化1 (wt)，由pAVEOl化 表達；（圖 1B)ApoLl(A2ins)，由pAVEOl化表達；（圖 1C)ApoLl(A2ins)，由pSt油yl. 2 表達；（圖ID)ApoLl巧E2del)，ApoLl巧EA2del)，由pSt油yl. 2 表達；和（圖IE)ApoLl 巧EA2del)，由pSt油yl.2表達。通過自動化的Edman降解法鑒定氨基酸序列。對每個反應 循環顯示確定的氨基酸數量，Wpmol表示，并且突出顯示每個循環中的優勢氨基酸。 圖2顯不了由內切蛋白酶Lys-C酶切的ApoLl野生型（圖2A)、ApoLlA2ins(圖 2B)，和Ap化1EE2del(圖2C)的RP-HPLC譜圖。指出了對應于N-末端膚片段的峰。顯示的 氨基酸序列源自于MS分析。測定的質量對于ApoLl野生型為2502. 15Da(預期為；2502. 54 Da);對于ApoLlA2ins為 2442. 15Da(預期為；2442. 42Da);且對于ApoLl邸 2del為 2113. 03Da(預期為；2113. 13Da)(數據未顯示）。 圖3顯示了在Ap化1的存在下錐蟲的生長抑審。將布氏錐蟲細胞稀釋物與指定量 的ApoLl-起在300W的終體積中在37°C溫育20小時的時間段。隨后，使用巧光氧化還 原指示劑AlamarBlue測定錐蟲的代謝活性。
技術實現思路
本專利技術部分地基于下述發現，即野生型ApoLl的翻譯后加工沒有完全地除去末端 或f-Met。 本專利技術包括修飾的Apo-Ll多膚，其中所述多膚在重組表達時缺少N-末端甲硫氨 酸（Met)或甲酯甲硫氨酸。在某些實施方式中，所述多膚包含插入在N-末端Met和相鄰的 殘基之間的氨基酸殘基，包括插入在N-末端Met和所述相鄰的殘基之間的丙氨酸殘基。在 進一步的實施方式中，所述相鄰的殘基是谷氨酸殘基。本專利技術提供了修飾的Apo-Ll多膚， 其包含SEQIDNO: 2或SEQIDNO: 4的氨基酸序列。 在另一個實施方式中，所述修飾的Apo-Ll多膚包含與N-末端Met相鄰的至少一 個氨基酸殘基的缺失。在可選的實施方式中，所述修飾的Apo-Ll包含與N-末端Met相鄰的 至少兩個氨基酸殘基的缺失，其中所述相鄰的殘基為谷氨酸。本專利技術提供了修飾的Ap化1 多膚，其包含SEQIDNO:6的氨基酸序列。在可選的實施方式中，所述修飾的Apo-Ll包含 與N-末端Met相鄰的至少S個氨基酸殘基的缺失，其中所述相鄰的殘基為兩個谷氨酸，和 一個丙氨酸。本專利技術提供了修飾的Apo-Ll多膚，其包含SEQIDNO:8的氨基酸序列。在 某些實施方式中，所述修飾的ApoLl多膚由細菌細胞重組表達，所述細菌細胞包括大腸桿 菌細胞。 本專利技術提供了編碼修飾的Apo-Ll多膚的分離的核酸，其包含選自SEQIDNOs: 1、 3、5和7的核酸序列。還提供了包含選自SEQIDNOs: 1、3、5和7的核酸的表達載體，和包 含所述表達載體的宿主細胞。 本專利技術進一步提供了產生多膚的方法，包括；在表達所述核酸序列的條件下在培 養基中培養所述宿主細胞，從而產生所述修飾的Apo-Ll多膚；和從所述宿主細胞或培養基 回收所述修飾的Apo-Ll多膚。在進一步的實施方式中，所述宿主細胞是細菌細胞，包括大 腸桿菌細胞。[001引專利技術詳述 除非文中另有清楚指明，如本文，包括后附的權利要求書中使用的，單數形式的詞語， 例如"一"（"a, " "an,"和"the,")包括其相應的復數指代形式。 本文中引用的所有文獻均通過引用并入本文，達到如具體且單獨地指出每個單獨 的出版物、專利申請或專利被通過引用并入本文的相同程度。 I.定義。/虹g蛋白]，或/虹g蛋 白]]等。"載脂蛋白L1"或"Ap化1"是指編碼人載脂蛋白L1的基因，或者蛋白Ap化1。Ap化1 是分泌的高密度脂蛋白，其結合載脂蛋白A-I。載脂蛋白A-I是相對豐富的血漿蛋白，并且 是皿L的主要脫輔蛋白質。"多膚片段"是指多膚（例如，ApoLl多膚，抗ApoLl抗體或ApoLl括抗劑（例如，Ap化1-結合多膚，例如SRA)或編碼ApoLl多膚、抗ApoLl抗體、ApoLl括抗劑（例如SRA) 或反義ApoLl分子的核酸分子）的一部分，其具有與參照蛋白或核酸的一部分基本相同的 區域，并且保持所述參照蛋白或核酸的至少50%或75%，更優選80%、90%或95%，或甚至99% 的至少一種生物活性，但不包括全長多膚或核酸分子的全部氨基酸或核酸序列。例如，相對 于全長多膚或核酸分子（例如，ApoLl多膚，抗ApoLl抗體或ApoLl括抗劑（例如SRA)或編 碼ApoLl多膚、抗ApoLl抗體、ApoLl括抗劑（例如SRA)或反義ApoLl分子的核酸分子）， 所述片段可具有少至少1個，至少5個，至少10、20、30、40、50、60、70、80、90或100個，或更 多（例如，多至200、300個或更多）的氨基酸殘基或核酸堿基。本文檔來自技高網...

【技術保護點】
修飾的Apo?L1多肽，其中所述多肽在重組表達時缺少N?末端甲硫氨酸(Met)或甲酰甲硫氨酸。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：M霍恩，Z劉，
申請(專利權)人：默沙東公司，
類型：發明
國別省市：美國;US