本發明專利技術涉及一種具有抗氧化活性的灰樹花蛋白酶解物的制備方法，屬于生物酶解技術領域。該方法采用“超聲波破碎–堿溶酸沉”工藝提取灰樹花子實體中的蛋白質，然后通過堿性蛋白酶的可控酶解工藝制備蛋白酶解物，最后采用“離心–超濾–干燥”工藝分離出具有抗氧化活性的蛋白酶解物組分。本發明專利技術所制備的灰樹花子實體蛋白酶解物具有較強的DPPH自由基和羥自由基清除率及較強的還原力，是潛在的天然抗氧化劑和功能性食品，具有有效地保護人體細胞組織、心腦血管循環系統及抗癌、延緩衰老等生理作用。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及，屬于生物酶解
技術介紹
灰樹花（Cri/b/a fro/?t/iosa)屬擔子菌亞門層菌綱非裙菌目多孔菌科樹花菌屬真 菌，主要生長在亞熱帶至溫帶，在我國主要分布于福建、河北、吉林、廣西和四川等地。作為 一種珍貴的食、藥兼用蕈菌，灰樹花的多種營養素和生理功效成分居各種食用菌之首，其藥 用價值、食用價值遠遠高于靈芝，素有"食用菌王子"和"華北人參"之美譽。灰樹花具有廣 泛的藥理活性，如：抗腫瘤、抗糖尿病、抗氧化、抗福射、調節免疫及抗菌等功能活性。近年 來，隨著現代分離提取與純化技術的不斷發展和完善，灰樹花中活性組分的研宄取得了一 些成果。研宄發現，灰樹花含有多種生理活性物質，主要包括多糖、蛋白質或肽類、糖蛋白或 蛋白聚糖、脂類以及一些小分子化合物，其中灰樹花多糖是最主要的也是至今研宄得最為 透徹的生理活性成分。從灰樹花中提取的多糖主要具有抗腫瘤、抗糖尿病、抗肝炎，抗HIV 病毒、抗氧化等功效，提取出的多酚具有抗氧化、抗菌及抑制a _淀粉酶等活性。 人體內的氧化損傷與多種疾病如動脈粥樣硬化、心血管疾病、糖尿病、腫瘤等的發 生密切相關。近年來，食用菌的抗氧化作用開始受到關注，從食用菌中開發天然、高效的、具 有醫療保健功能的抗氧化食品或藥品具有較高的開發價值和廣闊的市場前景，己成為當今 一個重要的研宄方向。當前，對灰樹花抗氧化作用的研宄以證明其具備抗氧化性作用為多， 也有一些研宄涉及灰樹花抗氧化活性物質的分離提取工藝及其抗氧化活性的研宄。針對灰 樹花抗氧化活性物質的分離制備，如Zhang等從灰樹花菌絲中分離提純出具有抗氧化和抑 制環氧合酶（COX)的作用的小分子化合物物質；陳向東等采用弱極性的大孔吸附樹脂從灰 樹花菌絲體粗提物中分離出具有對氧化酶的抑制和對金屬離子的絡合作用的抗氧化多酚， 經過光譜分析鑒定為一種黃烷醇類物質；馮尚坤等以灰樹花菌絲體為原料通過中性蛋白酶 酶解制備抗氧化活性多肽，所制得的灰樹花多肽具有較強的超氧自由基和羥基自由基的清 除率；陳貴堂等人以灰樹花子實體為原材料，通過"堿溶酸沉"法提取灰樹花蛋白，以胰蛋白 酶可控酶解制備灰樹花抗氧化酶解物，然而所制得的蛋白酶解產物的抗氧化活性一直達不 到人工合成的抗氧化劑活性那么高，必須采用美拉德反應來進一步提高灰樹花蛋白酶解物 的抗氧化活性。
技術實現思路
本專利技術涉及，提供一種灰樹 花子實體蛋白的提取工藝、蛋白酶可控酶解工藝、蛋白酶解物的分離純化工藝，經"離心-超濾-干燥"分離純化工藝制備的灰樹花子實體蛋白酶解物具有較強的體外抗氧化活性 (DPPH自由基清除能力、輕自由基清除能力和還原力)。 -種具有抗氧化活性的灰樹花蛋白酶解物的制備方法，其制備步驟如下： 1) 原料預處理：將灰樹花子實體干制品粉碎成粉末，過40~80目篩； 2) 蛋白質提取：采用"超聲波破碎-堿溶酸沉"工藝提取灰樹花子實體中的蛋白質； 3) 酶解：將提取的灰樹花子實體蛋白溶解于蒸餾水后，置于酶解反應器中，加入堿性蛋 白酶，調節pH值，攪拌酶解； 4) 滅酶：酶解反應結束時，停止攪拌，將蛋白酶解液迅速升溫至70~KKTC，保持10~ 30分鐘，將蛋白酶滅活； 5) 離心分離：酶解液在1000~5000rpm離心5~20分鐘，收集上清液； 6) 超濾：上清液在0. 01~0. 25MPa，30~50°C，pH6~8條件下超濾，選用截留分子量 為5kD的超濾I吳超濾，超濾后獲得具有抗氧化活性的蛋白酶解液； 7) 干燥：將超濾后得到的蛋白酶解液干燥至白色粉末，即為具有抗氧化活性的灰樹花 子實體蛋白酶解物。 所述的灰樹花子實體蛋白質的提取包括以下步驟： 1) 稱取灰樹花子實體干粉，按固液質量比1:40~1:80加入蒸餾水，攪拌均勻； 2) 通過超聲波破碎儀破碎細胞，超聲波器輸出功率為100~300W，每次工作時間/間 歇時間為1~10秒/1~10秒，工作總時間為2~20分鐘； 3) 調pH值至10. 5~13. 0,磁力攪拌器攪拌，40~60°C水浴保溫1~4小時，3000~ 4500rpm離心10分鐘，獲得上清液； 4) 調pH值至3. 0~4. 0,攪拌均勻，3000~4500rpm離心10分鐘，棄上清液取沉淀； 5) 沉淀經冷凍真空干燥得灰樹花子實體蛋白粉。 本專利技術所述的灰樹花子實體蛋白的酶解反應，所用的灰樹花蛋白濃度為1%~10% (重量百分比)，所用的蛋白酶為堿性蛋白酶，堿性蛋白酶用量為灰樹花蛋白用量的〇. 50%~ 2. 5%，控制反應溫度為60~65°C，調整pH為8.0~12. 0,反應0.5~10小時。 本專利技術所述所述的超濾后得到的蛋白酶解液的干燥，是采用冷凍真空干燥、噴霧 干燥、真空干燥或加熱干燥。 以DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力和還原力為依據，證明了灰樹花子實 體蛋白酶解物具有較強的體外抗氧化活性，可以制備具有抗氧化活性的食品、食品配料或 保健品。 本專利技術提出以灰樹花子實體為原料，采用"超聲波破碎-堿溶酸沉"工藝提取灰 樹花子實體中的蛋白質，然后通過堿性蛋白酶的可控酶解工藝制備蛋白酶解物。相比以往 采用"堿溶酸沉"的蛋白提取工藝，該專利技術采用"超聲波破碎-堿溶酸沉"工藝使得灰樹花 子實體蛋白提取率顯著性提高；與現有的研宄報道相比，采用堿性蛋白酶酶解灰樹花蛋白 所制得的酶解產物的體外抗氧化活性也顯著性提高，其中還原力和DPPH自由基清除能力 均比等質量濃度（5mg/mL)的抗壞血酸強。此外，本專利技術所制備的抗氧化蛋白酶解物是經過 "離心-超濾-干燥"工藝進一步分離純化得到的蛋白酶解物組分，其中多肽的質量濃度 較高且具有較強的抗氧化活性，既可以作為具有延緩衰老的營養食品直接食用，也可以作 為食品配料或保健品。【具體實施方式】 下面結合實例，更具體的說明本
技術實現思路
。本專利技術的制備方法，并不局限于以下實 例，對本專利技術的制備方法有任何形式的改變，都將落入本專利技術的保護范圍。 實施例一 原料預處理：將灰樹花子實體干制品粉碎成粉末，過40目篩； 蛋白質提取：采用"超聲波破碎-堿溶酸沉"工藝提取灰樹花子實體中的蛋白質，具體 提取步驟如下： 稱取灰樹花子實體干粉5kg，按固液質量比1:40加入蒸餾水，攪拌均勻； 通過超聲波破碎儀破碎細胞，超聲波器輸出功率為150 W，每次工作時間/間歇時間為 5秒/5秒，工作總時間為10分鐘； 采用lmol/L氫氧化鈉溶液調pH值至10. 5,磁力攪拌器攪拌，50°C水浴保溫2小時， 4500rpm離心10分鐘，獲得上清液； 上清液用lmol/L鹽酸溶液調pH值至3. 0,攪拌均勻，4500rpm離心10分鐘，棄上清液 取沉淀； 沉淀經冷凍真空干燥得灰樹花子實體蛋白粉； 酶解：將提取的灰樹花子實體蛋白（Ig)置于250mL酶解反應器中，加入50mL蒸餾 水，添加諾維信公司生產的食品級堿性蛋白酶Alcalase 2. 4L，其用量為灰樹花蛋白量的 1. 〇%，控制反應溫度為60°C，調整pH為9. 0,反應2小時； 滅酶：酶解反應結束時，停止攪拌，將蛋白酶解液迅速升溫至95°C，保持20分鐘，將蛋 白酶滅活； 離心分離：酶解液在4500rpm離心10分鐘，收集上清液； 超濾：上清液在〇. 25MPa，本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種具有抗氧化活性的灰樹花蛋白酶解物的制備方法，其特征在于：將灰樹花子實體干制品粉碎后，經蛋白提取工藝、蛋白酶解工藝、“離心–超濾–干燥”分離純化工藝，制備具有抗氧化活性的灰樹花子實體蛋白酶解物。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：劉斌，呂旭聰，李燕，童愛均，趙立娜，林占熺，劉曉艷，李鑫，
申請(專利權)人：福建農林大學，
類型：發明
國別省市：福建;35
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