一種基于新型納米復合材料的蛋白質組樣品預處理方法及其應用技術

本發明專利技術涉及一種新型納米復合材料用于蛋白質樣品預處理的新方法。該材料用于蛋白質樣品預處理能夠有效減小高豐度蛋白質的豐度，降低樣品的復雜程度，鑒定到血漿中更多的中低豐度蛋白質。相比于傳統的蛋白質樣品預處理方法，具有方便易行、成本低廉等特點。

【技術實現步驟摘要】
一種基于新型納米復合材料的蛋白質組樣品預處理方法及其應用
本專利技術涉及蛋白質樣品預處理方法，具體地說是一種基于聚乙二醇修飾的聚乙烯亞胺偶聯的納米金修飾氧化石墨烯納米復合物的制備及其在蛋白質樣品預處理中的應用。
技術介紹
生物樣品內蛋白質的組成極其復雜，而且動態范圍比較寬，濃度差異大（豐度差異大），比如血漿樣品中前10種高豐度蛋白質含量占到總蛋白質含量的90%，前22種蛋白質占到99%，余下幾千種蛋白卻僅占到1%，高豐度蛋白質的存在會掩蓋低豐度蛋白質，從而干擾對低豐度蛋白質的鑒定，而這些低豐度蛋白質往往存在潛在的生物學意義，在疾病標志物的發現與治療方面可能會發揮重要生物功能（J.ProteomeRes.,2011,10,516）。因此在蛋白質樣品分析過程中需要降低其中高豐度蛋白質的豐度差別，縮小這種差異以方便用現有的檢測技術檢測到低豐度蛋白質成為蛋白質樣品預處理的核心問題之一。目前發展的去除高豐度蛋白質的技術方法主要包括染料配體法、超速離心過濾法、免疫去除法及預分級技術。染料配體法是將汽巴藍F3GA及其衍生物固定在聚甲基丙烯酸縮水甘油酯顆粒表面，通過染料跟白蛋白的相互作用去除人血清白蛋白(JournalofChromatographyB,2006,832,216-223)。該方法樣品的處理量大，但特異性較差。超速離心過濾法主要通過選擇具有不同截留分子量的膜實現蛋白質的分離，并去除某些分子量較大的高豐度蛋白質（Molecular&CellularProteomics,2003,2,10961103）。然而高豐度蛋白質并非都是大分子量的蛋白質，因此會存在對高豐度蛋白質去除不充分，而且可能會同時去除高分子量的低豐度蛋白質等問題。與前兩種去除方法相比，免疫去除法的特異性很高(MolCellProteomics2008,7,1963-1973;JProteomeRes2010,9,4982-4991;JProteomeRes.,2007,6,947-954)。然而，該方法仍存在很多不足，如，低豐度蛋白質易與部分高豐度蛋白質非特異性結合，產生共去除現象(Electrophoresis2010,31,471-482)；已發現的抗體種類少(20種)；處理樣品的體積有限；去除后的樣品被稀釋；不同蛋白質去除效率有一定差異性等。近期，人們還通過采用液相等電聚焦和多維液相色譜等方法進行樣品的預分級，有效地降低了樣品的復雜程度(J.ProteomeRes.,2009,8,11431155;Electrophoresis,2009,30:249-261;Electrophoresis,2010,31,35803585;J.ProteomeRes.,2009,8,11431155;J.ProteomeRes.,2010,9,1902-1912)。但是液相等電聚焦方法只能根據已有的等電點膜將樣品按照有限的等電點區間進行分級。因此，高豐度蛋白質所在級分仍存在對低豐度蛋白質的掩蓋問題。而多維液相色譜方法不僅操作繁瑣、運行時間長，而且也難以避免去除高豐度蛋白質的同時造成低豐度蛋白質的共洗脫。
技術實現思路
針對以上方法目前存在的不足，本專利技術提供一種簡便高效的蛋白質樣品處理方法以降低蛋白質樣品的復雜程度。為實現上述目的，本專利技術采用的技術方案為：在不同pH條件的緩沖溶液中，采用聚乙二醇修飾的聚乙烯亞胺偶聯的納米金修飾氧化石墨烯納米復合物顆粒處理蛋白質組樣品，以降低蛋白質組樣品中高豐度蛋白質的豐度，并同時實現蛋白質組樣品復雜程度的降低。所述聚乙二醇修飾的聚乙烯亞胺偶聯的納米金修飾氧化石墨烯納米復合物顆粒的制備與蛋白質樣品處理的具體步驟如下，（1）樣品處理方法中所述的材料聚乙二醇修飾的聚乙烯亞胺偶聯的納米金修飾氧化石墨烯納米復合物顆粒的制備：將氧化石墨烯分散于水中，超聲使其分散均勻。加入與氧化石墨烯質量比為10-1000倍的聚亞乙基亞胺（PEI），室溫震蕩反應5min-70min后，加入與聚亞乙基亞胺質量比為1/5-1/100的氯金酸（HAuCl43H2O），震蕩均勻，30-100℃反應5-90min。雙蒸水反復洗滌后，離心并分散于100μL水中。向200-500μL上述顆粒中加入25-100mgSH-PEG溶液，水溶液體系中反應2-24h，水洗滌即制得聚乙二醇修飾的聚乙烯亞胺偶聯的納米金修飾氧化石墨烯納米復合物顆粒。（2）體液樣品包括血液和尿液樣品；組織樣品包括動物組織樣品如動物大腦、心臟、肺、胃、肝臟等組織樣品；細胞樣品如Hela細胞樣品、類淋巴母細胞等細胞株樣品。（3）蛋白質樣品的處理：采用（1）制備的納米復合物顆粒與蛋白質樣品在pH值為3-10的緩沖溶液中孵育0.5-10h，孵育溫度為1-40℃。（4）蛋白質洗脫：將顆粒去除上清液后，采用與(2)中孵育溶液相同的緩沖液進行洗滌，去除上清液，得到納米復合材料與蛋白質的復合物。（5）聚丙烯酰胺凝膠電泳分析（SDS-PAGE）向（3）中所述納米復合材料與蛋白質的復合物中加入同等體積的SDS-PAGE上樣緩沖溶液，在沸水中煮沸后，將其加于凝膠孔道中。采用5%濃縮膠和12%的分離膠，在120V恒壓條件下進行分離。（6）蛋白質酶解：將（3）中得到的納米復合材料與蛋白質的復合物在50-100℃的溶液條件下加熱變性，再分別進行胰酶酶解。具體過程如下：向變性后的復合物中加入二硫蘇糖醇反應1.5h，實現蛋白質的還原過程，再加入碘乙酰胺溶液，避光條件下反應40min對蛋白質進行烷基化，最后加入與蛋白質質量比為25:1-50:1的胰蛋白酶，37℃進行酶解反應16h。離心后收集上清。（7）二維液質聯用分析與數據處理：將上述蛋白質酶解產物進行強陽離子交換-反相液質聯用(SCX-RP-LC-MS/MS)分析。質譜數據采用Mascot檢索。本專利技術具有如下優點：（1）本專利技術所采用的樣品處理方法能夠有效降低樣品中高豐度蛋白質的豐度，降低復雜樣品的復雜程度；（2）制備的顆粒穩定，制備方法與樣品處理結果重現性好，；（3）樣品處理方法耗費少，操作簡便，通過離心操作便能實現，不需要液相色譜、電泳儀等儀器輔助，且無需使用抗體柱等。附圖說明圖1為聚乙烯亞胺偶聯的納米金修飾氧化石墨烯納米復合物顆粒透射電鏡圖圖2為聚丙烯酰胺凝膠電泳分析蛋白質樣品結果圖具體實施方式下面采用具體實施例對本專利技術的技術方案做進一步說明。實施例11.材料表征制備的聚乙烯亞胺偶聯的納米金修飾氧化石墨烯納米復合物顆粒透射電鏡結果表征如圖1所示，根據該圖可看出納米金顆粒在石墨烯層中分散均勻，說明石墨烯層上修飾的聚亞乙基亞胺成功還原氯金酸溶液，在其表面生成納米金顆粒，并且材料具有很好的分散性。2.樣品處理過程將制備的納米復合物顆粒與血漿蛋白質樣品在pH值為4.0,7.4,9.0的三種磷酸緩沖溶液中孵育0.5h，孵育溫度為25℃。將顆粒離心去除上清液后，采用與孵育溶液pH值相同的磷酸緩沖液進行洗滌，去除上清液，得到納米復合材料與蛋白質的復合物。3.聚丙烯酰胺凝膠電泳分析（SDS-PAGE）向上述的納米復合材料與蛋白質的復合物中加入同等體積的SDS-PAGE上樣緩沖溶液，在沸水中煮沸后，將其加于凝膠孔道中。采用5%濃縮膠和12%的分離膠，在120V恒壓條件下進行分本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種基于新型納米復合材料的蛋白質組樣品預處理方法，其特征在于：新型納米復合材料與蛋白質組樣品在不同pH值的緩沖液中進行孵育，并采用相應緩沖液洗滌后，得到相應pH條件下材料與蛋白質的復合物。

【技術特征摘要】
1.一種基于新型納米復合材料的蛋白質組樣品預處理方法，其特征在于：新型納米復合材料與蛋白質組樣品在不同pH值的緩沖液中進行孵育，并采用相應緩沖液洗滌后，得到相應pH條件下材料與蛋白質的復合物:緩沖液pH值為3-10，所述緩沖液為磷酸緩沖液、檸檬酸緩沖液、乙酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液中的一種或兩種以上；(1)將氧化石墨烯分散于水中，超聲使其分散均勻；加入與氧化石墨烯質量比為10-1000倍的聚乙烯亞胺，室溫震蕩反應5min-70min后，加入與聚乙烯亞胺質量比為1/5-1/100的氯金酸，震蕩均勻，30-100℃反應5-90min；雙蒸水反復洗滌后，離心并分散于100μL水中；向200-500μL上述顆粒中加入25-100mg巰基-聚乙二醇溶液，水溶液體系中反應2-24h...

【專利技術屬性】
技術研發人員：張麗華，鄧楠，江波，陳遠波，吳琪，楊開廣，梁振，張玉奎，
申請(專利權)人：中國科學院大連化學物理研究所，
類型：發明
國別省市：遼寧;21