多重試管捕捉RT-PCR的方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種多重試管捕捉RT-PCR的方法，本發(fā)明專利技術(shù)針對(duì)多種病毒病同時(shí)侵染的樣品可經(jīng)一個(gè)反應(yīng)一次就檢測(cè)出來(lái)，對(duì)多種不同病毒病也可經(jīng)一個(gè)反應(yīng)依次檢測(cè)出來(lái)，省時(shí)省力。并且省去了RNA的提取步驟，進(jìn)而省去了RNA提取時(shí)所需的試劑費(fèi)，從而避免了RNA提取時(shí)的復(fù)雜操作，尤其是多種病毒同時(shí)檢測(cè)時(shí)，前期幾種RNA的提取更是費(fèi)時(shí)費(fèi)力，此技術(shù)只需要將幾種病毒病的粗提液同時(shí)加入同一個(gè)管中，操作簡(jiǎn)單。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種多重試管捕捉RT?PCR的方法，其特征在于：包括如下步驟：1）磨樣：取三種病毒病病葉，向病葉中加入樣品提取緩沖液充分研磨后，在溫度為4?℃、轉(zhuǎn)速為?10000r/min的條件下離心10min，獲得病毒粗提取液；2）包被?：取PCR管，用經(jīng)步驟1）獲得的TMV、CMV和PVY的病毒的粗提液同時(shí)包被，在37℃的水浴中放置3h或在4℃下過(guò)夜；然后用洗滌緩沖液洗管3次，DEPC水洗1次；3）反轉(zhuǎn)錄：直接在?PCR管中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；向已捕捉抗原的PCR?管中同時(shí)加入TMV、CMV和PVY三種病毒的反向引物、DEPC水、5×M?MuLV?反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液、dNTPs以及Oligo(dT18)，然后在70℃的水浴中放置10min后，立即在冰浴下冷卻5min，再加入RNasin以及M?MuLV?反轉(zhuǎn)錄酶；經(jīng)42℃1?h，70℃10?min?合成?cDNA，在?20℃下保存?zhèn)溆茫?）PCR?擴(kuò)增：在同一個(gè)管中同時(shí)加入TMV、CMV和PVY三種病毒的正反向引物、10×buffer、dNTP?mix、rTaq以及cDNA，用ddH2O定容；PCR反應(yīng)程序是：94℃?3?min、94℃?30?s、52℃?45?s、72℃?1?min，共30個(gè)循環(huán)，最后一輪循環(huán)后，72℃延伸10?min；PCR?反應(yīng)結(jié)束后，取PCR?產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，經(jīng)溴化乙錠染色后在凝膠成像儀上觀察結(jié)果。...

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：任錫毅，劉作易，黃永會(huì)，劉永翔，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：貴州省生物技術(shù)研究所，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：貴州;52