靶向液泡ATP酶C亞基并賦予對(duì)鞘翅目有害生物的抗性的核酸分子制造技術(shù)

本公開內(nèi)容涉及靶向液泡ATP酶C亞基并賦予對(duì)鞘翅目有害生物的抗性的核酸分子。本公開內(nèi)容關(guān)注核酸分子及其用于經(jīng)由RNA干擾介導(dǎo)的對(duì)鞘翅目有害生物中靶編碼和轉(zhuǎn)錄非編碼序列的抑制來控制鞘翅目有害生物的使用方法。本公開內(nèi)容還關(guān)注用于生成轉(zhuǎn)基因植物的方法及通過該方法獲得的植物細(xì)胞和植物，所述轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)可用于控制鞘翅目有害生物的核酸分子。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
靶向液泡ATP酶C亞基并賦予對(duì)鞘翅目有害生物的抗性的核酸分子本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2011年12月30日、中國申請(qǐng)?zhí)枮?01180068838.9、專利技術(shù)名稱為“靶向液泡ATP酶C亞基并賦予對(duì)鞘翅目有害生物的抗性的核酸分子”的專利技術(shù)申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。優(yōu)先權(quán)要求本申請(qǐng)要求2010年12月30日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)流水號(hào)61/428,608關(guān)于“NUCLEICACIDMOLECULESTHATTARGETTHEVACUOLARATPASECSUBUNITANDCONFERRESISTANCETOCOLEOPTERANPESTS”的申請(qǐng)日(filingdate)權(quán)益。專利
一般而言，本專利技術(shù)涉及對(duì)由鞘翅目有害生物(pest)引起的植物損傷的遺傳控制。在特定的實(shí)施方案中，本專利技術(shù)涉及靶編碼和非編碼序列的鑒定，及重組DNA技術(shù)用于轉(zhuǎn)錄后阻抑或抑制鞘翅目有害生物細(xì)胞中靶編碼和非編碼序列的表達(dá)以提供植物保護(hù)效果的用途。專利技術(shù)背景西部玉米根蟲(westerncornrootworm,WCR)，即玉米根螢葉甲(DiabroticavirgiferavirgiferaLeConte)是北美洲最具破壞性的玉米根蟲物種之一，并且是美國中西部玉米生長區(qū)的一項(xiàng)特定憂慮。北部玉米根蟲(northerncornrootworm,NCR)，即北美玉米根螢葉甲(DiabroticabarberiSmithandLawrence)是一種與WCR共同駐留于大量相同范圍的緊密相關(guān)物種。存在著作為北美洲重要的有害生物的幾種其它相關(guān)根螢葉甲屬亞種：墨西哥玉米根蟲(MCR)，即D.virgiferazeaeKrysanandSmith；南方玉米根蟲(SCR)，即D.undecimpunctatahowardiBarber；D.balteataLeConte；D.undecimpunctatatenella；和D.u.undecimpunctataMannerheim。美國農(nóng)業(yè)部目前估計(jì)玉米根蟲每年造成10億美元收入損失，包括8億美元產(chǎn)量損失和2億美元處理成本。WCR和NCR兩者在夏季期間在土壤中以卵沉積。該昆蟲遍及整個(gè)冬季保持為卵階段。卵是橢圓的、白色、且長度小于0.004英寸。幼蟲在5月下旬或6月上旬孵出，卵孵出的精確時(shí)機(jī)由于溫度差異和位置而在各年間有所變化。新孵出的幼蟲是白色的蠕蟲，其長度小于0.125英寸。一旦孵出，幼蟲便開始以玉米根為食。玉米根蟲經(jīng)歷三個(gè)幼蟲齡。在進(jìn)食幾周后，幼蟲蛻皮，進(jìn)入蛹階段。它們?cè)谕寥乐谢迹缓笏鼈冊(cè)?月和8月中以成蟲自土壤出現(xiàn)。成年根蟲長度是約0.25英寸。玉米根蟲幼蟲在玉米和幾種其它禾本科物種上完成發(fā)育。黃色狐尾草(yellowfoxtail)上飼養(yǎng)的幼蟲較晚出現(xiàn)，并且作為成蟲比玉米上飼養(yǎng)的幼蟲具有更小的頭殼尺寸。Ellsbury等(2005)Environ.Entomol.34:627-34。WCR成蟲以暴露的穗尖端的谷粒、玉米穗絲、和花粉為食。若WCR成蟲在存在玉米生殖組織前出現(xiàn)，則它們可以以葉組織為食，由此減緩植物生長，且偶而殺死宿主植物。然而，成蟲會(huì)在優(yōu)選的穗絲和花粉變得可得到時(shí)快速向其轉(zhuǎn)移。NCR成蟲也以玉米植物的生殖組織為食，但是比較而言，很少以玉米葉為食。玉米中的大部分根蟲損傷通過幼蟲進(jìn)食引起。新孵出的根蟲最初以較細(xì)的玉米根毛為食，并且鉆入根尖中。隨著幼蟲生長得更大，它們以初生根為食并鉆入其中。在富含玉米根蟲時(shí)，幼蟲進(jìn)食經(jīng)常導(dǎo)致自始至終向玉米桿基部修剪根。重度根損傷干擾根將水和營養(yǎng)物轉(zhuǎn)運(yùn)到植物中的能力，降低植物生長，并且導(dǎo)致降低的谷粒生產(chǎn)，由此經(jīng)常顯著降低總體產(chǎn)量。重度根損傷還經(jīng)常導(dǎo)致玉米植物的倒伏，其使收獲變得更難，而且進(jìn)一步降低產(chǎn)量。此外，成蟲以玉米生殖組織為食可以導(dǎo)致穗尖端的穗絲修剪。若此“穗絲剪切”在花粉脫落期間足夠嚴(yán)重，則傳粉可能受到破壞?？梢酝ㄟ^作物輪種、化學(xué)殺昆蟲劑、生物殺蟲劑(例如，孢子形成革蘭氏陽性細(xì)菌蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis))、或其組合嘗試控制玉米根蟲。作物輪種遭受對(duì)農(nóng)田的使用放置不想要的限制的重大缺點(diǎn)。此外，一些根蟲物種的產(chǎn)卵可以在大豆田間發(fā)生，由此降低用玉米和大豆實(shí)施的作物輪種的效率。化學(xué)殺昆蟲劑最嚴(yán)重依賴于實(shí)現(xiàn)玉米根蟲控制的策略?；瘜W(xué)殺昆蟲劑用途(盡管)是一種不完美的玉米根蟲控制策略；在將化學(xué)殺昆蟲劑的成本添加到盡管使用殺昆蟲劑仍可以發(fā)生的根蟲損傷的成本時(shí)在美國每年由于玉米根蟲可能損失超過10億美元。高幼蟲群體、大雨、和不適當(dāng)?shù)臍⒗ハx劑應(yīng)用均可以導(dǎo)致不充分的玉米根蟲控制。此外，殺昆蟲劑的連續(xù)使用可以選擇殺昆蟲劑抗性根蟲品系，以及由于它們中許多對(duì)非靶物種的毒性而提高重大的環(huán)境憂慮。RNA干擾(RNAi)是一種利用內(nèi)源細(xì)胞途徑的方法，由此對(duì)足夠大小的整個(gè)或任何部分靶基因序列特異性的干擾RNA(iRNA)分子(例如，dsRNA分子)導(dǎo)致由其編碼的mRNA的降解。在最近幾年中，已經(jīng)使用RNAi在許多物種和實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，例如線蟲秀麗隱桿線蟲(C.elegans)、植物、昆蟲胚胎、和組織培養(yǎng)物中的細(xì)胞)實(shí)施基因“敲低”。參見例如Fire等(1998)Nature391:806-11；Martinez等(2002)Cell110:563-74；McManus和Sharp(2002)NatureRev.Genetics3:737-47。RNAi經(jīng)由內(nèi)源途徑，包括DICER蛋白質(zhì)復(fù)合物實(shí)現(xiàn)mRNA的降解。DICER將較長的dsRNA分子切割成約20個(gè)核苷酸的短片段，稱作小干擾RNA(siRNA)。siRNA解開成兩個(gè)單鏈RNA：乘客鏈(passengerstrand)和引導(dǎo)鏈(guidestrand)。乘客鏈?zhǔn)艿浇到猓龑?dǎo)鏈摻入RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)中。微小抑制性核糖核酸(miRNA)分子可以類似地?fù)饺隦ISC中。轉(zhuǎn)錄后基因沉默在引導(dǎo)鏈特異性結(jié)合mRNA分子的互補(bǔ)序列并且誘導(dǎo)Argonaute(RISC復(fù)合物的催化組分)切割時(shí)發(fā)生。盡管在一些真核生物諸如植物、線蟲類和一些昆蟲中siRNA和/或miRNA的濃度最初是有限的，但已知此過程遍及整個(gè)生物體系統(tǒng)性擴(kuò)散。僅與siRNA和/或miRNA互補(bǔ)的轉(zhuǎn)錄物受到切割和降解，如此mRNA表達(dá)的敲低是序列特異性的。在植物中，存在DICER基因的幾個(gè)功能性組。RNAi的基因沉默效應(yīng)持續(xù)數(shù)天，并且在實(shí)驗(yàn)條件下，可以導(dǎo)致靶定轉(zhuǎn)錄物的豐度下降90％或更多，隨之發(fā)生相應(yīng)蛋白質(zhì)的水平降低。美國專利7,612,194和美國專利公開文本No.US2007/0050860,US2010/0192265,和US2011/0154545披露了自玉米根螢葉甲蛹分離的9112種表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)序列的文庫。在美國專利7,612,194和美國專利公開文本No.US2007/0050860中提出將核酸分子與啟動(dòng)子可操作連接以在植物細(xì)胞中表達(dá)反義RNA，所述核酸分子與其中披露的玉米根螢葉甲液泡型H+-ATP酶(V-ATP酶)的幾個(gè)特定部分序列之一互補(bǔ)。美國專利公開文本No.US2010/0192265提出將啟動(dòng)子與核酸分子可操作連接以在植物細(xì)胞中表達(dá)反義RNA，所述核酸分子與未知的且未披露的功能的玉米根螢葉甲基因的特定部分序列互補(bǔ)(本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種用于控制鞘翅目有害生物群體的方法，包括提供包含雙鏈核糖核酸分子的制劑，其在與所述鞘翅目有害生物接觸后發(fā)揮功能以抑制所述鞘翅目有害生物內(nèi)的生物學(xué)功能，其中所述制劑包含選自下組的核苷酸序列：SEQ?ID?NO:2；SEQ?ID?NO:2的互補(bǔ)物；SEQ?ID?NO:2的至少19個(gè)連續(xù)核苷酸的片段；SEQ?ID?NO:2的至少19個(gè)連續(xù)核苷酸的片段的互補(bǔ)物；包含SEQ?ID?NO:2的根螢葉甲屬生物體的天然編碼序列；包含SEQ?ID?NO:2的根螢葉甲屬生物體的天然編碼序列的互補(bǔ)物；轉(zhuǎn)錄成天然RNA分子的根螢葉甲屬生物體的天然非編碼序列，其包含SEQ?ID?NO:2；轉(zhuǎn)錄成天然RNA分子的根螢葉甲屬生物體的天然非編碼序列的互補(bǔ)物，所述天然非編碼序列包含SEQ?ID?NO:2；根螢葉甲屬生物體的天然編碼序列的至少19個(gè)連續(xù)核苷酸的片段，所述天然非編碼序列包含SEQ?ID?NO:2；根螢葉甲屬生物體的天然編碼序列的至少19個(gè)連續(xù)核苷酸的片段的互補(bǔ)物，所述天然編碼序列包含SEQ?ID?NO:2；轉(zhuǎn)錄成天然RNA分子的根螢葉甲屬生物體的天然非編碼序列的至少19個(gè)連續(xù)核苷酸的片段，所述天然非編碼序列包含SEQ?ID?NO:2；和轉(zhuǎn)錄成天然RNA分子的根螢葉甲屬生物體的天然非編碼序列的至少19個(gè)連續(xù)核苷酸的片段的互補(bǔ)物，所述天然非編碼序列包含SEQ?ID?NO:2。...

【技術(shù)特征摘要】
2010.12.30 US 61/428,6081.一種用于減少鞘翅目有害生物群體的方法，該方法包括使該群體的鞘翅目有害生物接觸包含第一和第二多核糖核苷酸的雙鏈核糖核酸(dsRNA)分子，其在與所述鞘翅目有害生物接觸后發(fā)揮功能以抑制所述鞘翅目有害生物內(nèi)的生物學(xué)功能，其中所述第一多核糖核苷酸由這樣的多核苷酸編碼：該多核苷酸由SEQIDNO:2的至少19個(gè)連續(xù)核苷酸或其互補(bǔ)物組成，其中該多核苷酸包含選自下組的序列：SEQIDNO:5、SEQIDNO:5的互補(bǔ)物、SEQIDNO:6、SEQIDNO:6的互補(bǔ)物、SEQIDNO:7、SEQIDNO:7的互補(bǔ)物、SEQIDNO:5的片段、SEQIDNO:5的互補(bǔ)物的片段、SEQIDNO:6的片段、以及SEQIDNO:6的互補(bǔ)物的片段；并且其中所述第一多核糖核苷酸在該dsRNA分子中與所述第二多核糖核苷酸特異性雜交。2.權(quán)利要求1的方法，其中通過用包含所述dsRNA分子的植物細(xì)胞喂養(yǎng)鞘翅目有害生物來使該鞘翅目有害生物與所述dsRNA分子接觸。3.依照權(quán)利要求...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：K·E·納瓦，H·李，C·耿，I·拉里諾阿，M·B·奧爾森，N·埃蘭戈，M·J·亨利，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：陶氏益農(nóng)公司，
類型：發(fā)明
國別省市：美國;US