本發明專利技術涉及在本文稱作DSM?2的新型選擇性標記基因。這種基因是在天藍色鏈霉菌A3中鑒定的。DSM?2蛋白與PAT和BAR的關系較遠。主題的發明專利技術還提供按植物優化的編碼DSM?2蛋白的基因。DSM?2可以用作轉基因性狀以在植物和植物細胞中賦予對除草劑草銨膦和雙丙氨酰膦的耐受。主題的基因的一種優選用途是作為選擇性標記。在細菌系統中使用這種基因作為選擇性標記能夠增加植物轉化的效率。使用DSM?2作為單一的選擇標記消除了在克隆過程中對額外的藥用抗生素標記(例如氨芐青霉素抗性)的需求。按照主題的發明專利技術還可以有多種其它用途。
【技術實現步驟摘要】
新型選擇性標記基因本申請是2017年12月7日遞交的申請號為200780051075.0、專利技術名稱為“新型選擇性標記基因”的專利技術專利申請的分案申請。專利技術背景選擇性標記是一種可以檢測的遺傳性狀或能夠被鑒定和追蹤的DNA區段(segment)。標記基因通常充當另一基因(有時稱為靶基因)的標志(flag)。標記基因通常與用于轉化靶細胞的靶基因一起使用。以可遺傳的方式接納靶基因的靶細胞能夠通過選擇也表達標記基因的細胞來鑒定。標記基因與靶基因足夠接近，因而所述兩個基因(標記基因和靶基因)在遺傳上連鎖并且通常一起遺傳。目前選擇性標記的標準是“pat”基因，其編碼稱為膦絲菌素乙酰轉移酶的酶。谷氨酰胺合成酶(“GS”)在許多植物中是植物細胞發育和生活的關鍵酶。GS將谷氨酸轉化成谷氨酰胺。GS還參與氨同化和氮代謝。GS參與了在大多數植物中用于解毒由硝酸還原釋放的氨的途徑中。因此，GS的強力抑制劑對于植物細胞的毒性非常大。分解或修飾植物內的除草劑能夠導致抗性。基于植物中因抑制GS而產生的毒性作用，開發了一類特殊的除草劑。雙丙氨酰膦(Bialaphos)和膦絲菌素是兩個這樣的作用于GS的抑制劑并且擁有出色的除草性質。這兩種除草劑是非選擇性的；它們抑制土壤上存在的全部不同種類植物的生長，因此引起對它們的整體破壞。雙丙氨酰膦也是一種廣譜除草劑。雙丙氨酰膦由膦絲菌素(PPT或PTC；2-氨基-4-甲基膦基丁酸)、L-谷氨酸類似物和兩個L-丙氨酸殘基組成。因此PPT和雙丙氨酰膦之間的結構差異在于PPT缺少兩個丙氨酸氨基酸。通過胞內肽酶將雙丙氨酰膦的L-丙氨酸殘基去除的情況下，則釋放PPT。PPT是GS的有利抑制劑。在植物中通過PPT對GS的抑制引起氨的迅速積累和植物細胞的死亡。雙丙氨酰膦最初被披露具有抗生素特性，這使得它能夠用作殺蟲劑或殺真菌劑。美國專利第3,832,394號涉及培養吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)，和從它的培養基回收雙丙氨酰膦。然而，其它菌株，例如綠色產色鏈霉菌(Streptomycesviridochromogenes)，也產生這種化合物。其它含有PPT模塊(moiety)的三肽抗生素也已知存在于自然界中，例如磷丙氨菌素(phosalacin)。PPT也是通過化學合成獲得的并且進行商業銷售。產雙丙氨酰膦的吸水鏈霉菌和綠色產生鏈霉菌受到具有膦絲菌素乙酰轉移酶活性的酶的保護而不受PPT毒性影響。PlantPhysiol，April2001，Vol.125，pp.1585-1590(“ExpressionofbarinthePlastidGenomeConfersHerbicideResistance,”Lutz等)。產生這些抗生素的鏈霉菌屬菌種(Streptomycesspecies)本身會受到破壞，如果它們不具有針對這些抗生素的自我防御機制。已經發現這種自我防御機制在多種情況下包含能夠抑制抗生素作用的酶。膦絲菌素乙酰轉移酶由bar(雙丙氨酰膦抗性；Thompson等，1987)或pat(膦絲菌素乙酰轉移酶；Strauch等，1988)基因編碼，并且通過乙酰化PPT的游離氨基來解毒PPT。由這兩種基因編碼的酶功能上相同并且在氨基酸水平顯示85％同一性(Wohlleben等，1988；Wehrmann等，1996)。已經通過自核基因在胞質中表達嵌合的bar或pat基因獲得了PPT抗性作物。已經通過在煙草(煙草栽培種PetitHavana(NicotianatabacumcvPetitHavana))、馬鈴薯、歐洲油菜(Brassicanapus)、甘藍(Brassicaoleracea)(DeBlock等，1987；DeBlock等，1989)、玉米(Spencer等，1990)和稻(Cao等，1992)中直接選擇PPT抗性獲得了除草劑抗性品系。在天藍色鏈霉菌A3(StreptomycescoelicolorA3)中鑒定了與hrdDσ因子基因相鄰的一個基因(bar)。預測的bar產物與產生雙丙氨酰膦的綠色產色鏈霉菌和吸水鏈霉菌的pat和bar基因的產物分別顯示了32.2％和30.4％的同一性。當處于高拷貝數載體上克隆入天藍色鏈霉菌中時，天藍色鏈霉菌bar基因賦予對雙丙氨酰膦的抗性。Bedford等，Gene，1991Jul31；104(1)：39-45，“CharacterizationofageneconferringbialaphosresistanceinStreptomycescoelicolorA3(2).”。在其它微生物中異源表達這種基因，或將這種基因轉化入植物，迄今為止尚無報導。除草劑抗性性狀的用途參見DE3642829A和美國專利第5,879,903號(以及5,637,489；5,276,268；和5,273,894)，其中pat基因分離自綠色產色鏈霉菌。WO87/05629和美國專利第5,648,477號(以及5,646,024和5,561,236)涉及使用來自吸水鏈霉菌的bar基因用于保護植物細胞和植物免于谷氨酰胺合成酶抑制劑(例如PPT)的用途和植物中除草劑抗性的開發。將編碼對除草劑BASTA(Hoechst膦絲菌素)或Herbiace(MeijiSeika雙丙氨酰膦)的抗性的基因通過農桿菌感染導入煙草(煙草栽培種PetitHavanSR1)、馬鈴薯(馬鈴薯栽培種Benolima(SolanumtuberosumcvBenolima))和番茄(番茄(Lycopersicumesculentum))植物中，并且賦予了除草劑抗性。
技術實現思路
主題的專利技術涉及在此稱為DSM-2的新基因。這種基因是在天藍色鏈霉菌(A3)中鑒定的。DSM-2蛋白與PAT和BAR的關系較遠。主題的專利技術還提供按植物優化的編碼DSM-2蛋白的基因。DSM-2可以用作轉基因性狀以在微生物、植物細胞和植物中賦予對除草分子和抗菌分子、草銨膦(glufosinate)、膦絲菌素和/或雙丙氨酰膦的耐受。轉化入擬南芥(Arabidopsis)允許以高比例回收草銨膦。一旦導入，DSM-2基因能夠提供有效的選擇(significantselection)和整株植物抗性。主題的基因僅作為用于生物技術工程的選擇性標記就具有高固有價值。在一些優選的實施方案中，主題的基因可以用作標記用于選擇培養物中成功轉化的細胞，和溫室及田地中成功轉化的整株植物。這種基因和相似的同源物可以代替pat和/或bar使用。在細菌轉化系統中使用這種基因作為選擇性標記能夠增加對所有植物的轉化的效率。使用DSM-2作為單一的選擇標記消除了克隆過程中對額外的藥用抗生素標記(例如氨芐青霉素抗性)的需求。根據主題的專利技術還可能有多種其它用途。DSM-2可用作轉基因性狀以賦予植物對除草劑草銨膦和雙丙氨酰膦的耐受。這種基因也可以連同經修飾的農桿菌屬菌株(Agrobacteriumstrain)用作一種新型植物轉化系統的基礎。用于蛋白質產生并且納入了非藥用抗生素抗性標記基因的熒光假單胞菌(Pseudo本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種轉基因植物細胞，其包含編碼具有膦絲菌素乙酰轉移酶活性的蛋白質的多核苷酸，其中所述多核苷酸于65℃在6XSSC的條件下與編碼SEQ ID NO:2的核酸探針的完整補體雜交。/n
【技術特征摘要】
20061207 US 60/873,6021.一種轉基因植物細胞，其包含編碼具有膦絲菌素乙酰轉移酶活性的蛋白質的多核苷酸，其中所述多核苷酸于65℃在6XSSC的條件下與編碼SEQIDNO:2的核酸探針的完整補體雜交。
2.權利要求1的細胞，其中所述探針包含選自下組的序列：SEQIDNO:1和SEQIDNO:3。
3.權利要求1的細胞，其中所述蛋白質與SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。
4.一種載體，其包含在植物細胞中可操作的啟動子，和與所述啟動子可操作地連接的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼具有膦絲菌素乙酰轉移酶活性的蛋白質，并且其中所述多核苷酸于65℃在6XSSC的條件下與編碼SEQIDNO:2氨基酸序列的核酸探針的完整補體雜交。
【專利技術屬性】
技術研發人員：賈斯廷·M·利拉，特里·R·賴特，肖恩·M·拉塞爾，唐納德·J·默洛，史蒂文·R·韋伯，妮科爾·L·阿諾德，安德魯·E·魯賓遜，凱利·A·史密斯，
申請(專利權)人：陶氏益農公司，
類型：發明
國別省市：美國;US
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