本發明專利技術提供一種克服菊芋莖尖超低溫保存后再生苗玻璃化的方法，在預培養階段、裝載階段、PVS2玻璃化保護階段、洗滌卸載階段所使用的試劑中，均用果糖代替蔗糖，進行超低溫保存處理。本發明專利技術的方法可有效地防止超低溫保存后菊芋莖尖再生后玻璃化現象的發生，植株不經愈傷直接再生率可達40％以上，易于操作，適用于菊芋莖尖的超低溫保存。
【技術實現步驟摘要】
【專利摘要】本專利技術提供，在預培養階段、裝載階段、PVS2玻璃化保護階段、洗滌卸載階段所使用的試劑中，均用果糖代替蔗糖，進行超低溫保存處理。本專利技術的方法可有效地防止超低溫保存后菊芋莖尖再生后玻璃化現象的發生，植株不經愈傷直接再生率可達40％以上，易于操作，適用于菊芋莖尖的超低溫保存。【專利說明】
本專利技術涉及植物種質資源的小滴玻璃化法超低溫保存技術，具體地說，涉及一種 克服菊芋莖尖超低溫保存后再生苗玻璃化的方法。
技術介紹
菊芋（Helianthus tuberous L.)為菊科向日葵屬多年生草本植物，是一種生態經 濟型植物，具有很高的經濟價值、藥用價值、觀賞價值和生態價值。因其地上似菊，地下似芋 而得名。原產北美洲，在美國、加拿大、墨西哥等國廣泛分布。17世紀經歐洲傳入我國，在我 國東北三省、內蒙古、河北、河南等省均有分布。菊芋為無性繁殖作物，其繁殖能力很強，地 下塊莖以每年20倍以上的速度繁殖，我國西北地區菊芋已形成規模化生產。菊芋生態適應 性很廣，有很強的抗逆性。耐寒、耐旱、耐鹽堿、防風治沙。菊芋塊根中含有豐富的菊粉，菊 粉在食品中廣泛應用，可作為甜味增味劑，也是生產果糖的原料。菊芋被聯合國糧農組織稱 為"21世紀人畜共用作物"。利用菊芋塊莖轉化成乙醇和生物燃料等生物能源可應用在化 工、生物制藥、航天等領域。 植物種質資源的非原生境保存分為田間保存、試管苗保存和超低溫保存。菊芋種 質資源目前采用非原生境保存中的田間保存和試管苗保存。由于菊芋地下塊莖容易受到病 毒的侵害，使病毒大量積累，導致品種退化，產量降低，而城市土地開發、環境惡化也嚴重威 脅菊芋種質資源的安全保存。試管苗保存雖然具有占地面積小、不易受自然災害和病原菌 影響以及人力、財力投入少，便于種質資源交換及運輸等優點，但需要經常繼代更新，且經 多次繼代培養后面臨發生退化現象或產生變異等威脅。現已證明，植物組織材料經一系列 的超低溫保存步驟后，投入液氮保存（氣相液氮或液相液氮條件下），經化凍后仍能在一定 培養條件下再生出新的植株，并保持其遺傳穩定性。它避免了田間保存易受自然災害影響 而導致種質丟失或毀滅，以及試管苗組織培養保存中因多次繼代引起遺傳性狀變異或污染 的危險。 莖尖超低溫保存方法成功標準在于，經一系列超低溫保存處理后，化凍后的莖尖 在適宜條件下再生恢復培養后，需要直接成功再生成正常苗。然而經超低溫保存后再生恢 復培養階段，容易出現玻璃化現象，出現玻璃化現象的莖尖即使膨大也不易形成再生苗，再 生苗也容易死亡。玻璃化現象是指再生的苗成半透明狀，葉片呈淺綠色或黃綠色、葉片肥 厚，易發生畸形、卷曲或皺縮，葉片脆弱易碎。從解剖學上看，葉片無功能性氣孔，由于保衛 細胞的功能性失調不能關閉氣孔，玻璃化的葉片不具有柵欄組織，只有海綿組織。由于玻璃 化的植株呼吸和光合作用功能不健全，玻璃化苗的分化能力低下，難以繼代培養繁殖，更難 以移栽成活。 超低溫保存后玻璃化苗的產生與很多因素有關，與組織培養中試管苗的玻璃化現 象相比，影響因素更為復雜，可能涉及超低溫保存過程中的各個關鍵步驟，也可能涉及再生 恢復培養過程中的培養基和培養環境條件，如水分、光照、營養條件、激素水平等。超低溫保 存過程涉及多個關鍵步驟，如預培養、裝載、PVS2玻璃化保護、化凍、洗滌等，莖尖等材料在 超低溫保存過程中可能受到不同程度的滲透、脫水、化學毒害等脅迫，造成部分細胞失去活 力或者受到不同程度的傷害。若經化凍、洗滌和再生培養后，一些關鍵細胞的傷害得到了修 復，則有利于莖尖再生成苗。反之，則有可能發生玻璃化或形成愈傷等現象，不利于莖尖的 成功再生。 菊芋莖尖按常規方法超低溫保存后，出現了嚴重的玻璃化現象。過去文獻報道的 克服玻璃化現象的研究，多集中于克服或消除組織培養過程中的試管苗的玻璃化現象，對 克服超低溫保存后的玻璃化現象研究較少。克服超低溫保存后的玻璃化現象是解決超低溫 保存成功的關鍵環節之一。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供。 為了實現本專利技術目的，本專利技術的一種克服菊芋莖尖超低溫保存后再生苗玻璃化的 方法，所述方法包括以下步驟： 1)預培養：切取菊芋組培苗莖尖，在含有0. 3-0. 4mol/L果糖的MS液體培養基中， 25 °C暗培養2-3天； 2)裝載：預培養后的莖尖在含有2. Omol/L甘油和0. 4mol/L果糖的MS液體培養 基中 25°C裝載 30-40min ; 3) PVS2玻璃化保護劑處理：裝載后的莖尖轉入改良的PVS2玻璃化保護劑中(TC脫 水處理15_40min ; 4)小滴玻璃化法超低溫保存：步驟3)處理后的莖尖置于鋁箔條上，向莖尖上滴加 改良的PVS2玻璃化保護劑，使莖尖完全包裹于由保護劑形成的液滴中，將鋁箔條置于凍存 管中，然后投入液氣中保存； 5)解凍和洗滌：從液氮中取出凍存管，將鋁箔條上的莖尖浸入含有I. 2mol/L果糖 的MS培養液中室溫解凍和洗滌； 6)步驟5)處理后莖尖轉入恢復培養基中恢復培養。 其中，步驟3)和4)中所述改良的PVS2玻璃化保護劑為含有30%甘油、15%二甲 基亞砜、15%乙二醇和0. 4mol/L果糖的MS液體培養基。 前述的方法，步驟1)具體為：取4-5周苗齡的菊芋組培苗，逐層剝去外層葉片，至 剩余1-2片葉原基包圍莖尖分生組織，切取I. 5-2mm的莖尖，在含有0. 4mol/L果糖的MS液 體培養基中，60rpm，25°C暗培養2-3天。 前述的方法，步驟5)中共洗滌2次，每次lOmin，用含有I. 2mol/L果糖的MS培養 液進行洗漆。 前述的方法，步驟6)中所述恢復培養基為MS+0. lmg/LGA3+15g/L蔗糖，培養條件 為：于25°C培養箱中暗培養3-5天后，轉入正常光照條件下進行培養。 采用本專利技術提供的方法進行菊芋莖尖保存和再培養，有效避免了玻璃化現象的發 生，植株不經愈傷直接再生率可達40%以上。本專利技術提供的方法成本低廉、操作簡便，是克 服菊芋莖尖超低溫保存后再生苗玻璃化的一條有效途徑。 【專利附圖】【附圖說明】 圖1為本專利技術實施例1中菊芋試管苗照片。 圖2為本專利技術實施例1中菊芋莖尖照片。 圖3為本專利技術實施例1中超低溫保存后發生玻璃化現象的照片。 圖4為本專利技術實施例2中超低溫保存后不經愈傷直接再生成苗的照片。 【具體實施方式】 以下實施例用于說明本專利技術，但不用來限制本專利技術的范圍。若未特別指明，實施例 中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用原料均為市售商品。 MS液體培養基：蔗糖30克，MS培養基粉4. 43克（購于北京西美杰科技有限公司， 型號M519)，pH5. 8,定容至1L。 含0? 4mol/L果糖的MS液體培養基：果糖13. 25克，MS培養基粉4. 43克（購于北 京西美杰科技有限公司，型號M519)，pH5. 8,定容至1L。 MS固體培養基：MS培養基粉4. 43克（購于北京西美杰科技有限公司，型號M519)， 添加蔗糖30克，添加瓊脂8. 00g(購于黑龍江省哈爾濱市南崗區雨林科技用品商行）， pH5. 8,本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種克服菊芋莖尖超低溫保存后再生苗玻璃化的方法，其特征在于，包括以下步驟：1)預培養：切取菊芋組培苗莖尖，在含有0.3?0.4mol/L果糖的MS液體培養基中，25℃暗培養2?3天；2)裝載：預培養后的莖尖在含有2.0mol/L甘油和0.4mol/L果糖的MS液體培養基中25℃裝載30?40min；3)PVS2玻璃化保護劑處理：裝載后的莖尖轉入改良的PVS2玻璃化保護劑中0℃脫水處理15?40min；4)小滴玻璃化法超低溫保存：步驟3)處理后的莖尖置于鋁箔條上，向莖尖上滴加改良的PVS2玻璃化保護劑，使莖尖完全包裹于由保護劑形成的液滴中，將鋁箔條置于凍存管中，然后投入液氮中保存；5)解凍和洗滌：從液氮中取出凍存管，將鋁箔條上的莖尖浸入含有1.2mol/L果糖的MS培養液中室溫解凍和洗滌；6)步驟5)處理后莖尖轉入恢復培養基中恢復培養；其中，步驟3)和4)中所述改良的PVS2玻璃化保護劑為含有30％甘油、15％二甲基亞砜、15％乙二醇和0.4mol/L果糖的MS液體培養基。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：張金梅，陳曉玲，韓麗，盧新雄，辛霞，尹廣鹍，何娟娟，
申請(專利權)人：中國農業科學院作物科學研究所，
類型：發明
國別省市：北京;11
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