胚珠體細胞特異性啟動子及使用方法技術

本發明專利技術公開了用于調節異源核苷酸序列在植物中的表達的組合物和方法。組合物包含若干擬南芥(Arabidopsis?thaliana)胚珠體細胞組織優選啟動子AT-CYP86C1、AT-PPM、AT-EXT、AT-GILT1和AT-TT2的核苷酸序列。還提供了使用本文公開的啟動子序列在植物中表達異源核苷酸序列的方法。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
[〇〇〇1] 本專利技術涉及植物分子生物學領域，更具體而言涉及植物中基因表達的調節。
技術介紹
異源DNA序列在植物宿主中的表達有賴于在該植物宿主中有功能的可操作連接 的調節元件的存在。啟動子序列的選擇將決定在生物體中何時和何處表達異源DNA序列。 需要在特定組織或者器官中表達的情況下，可以使用組織優選啟動子。需要應答于刺激而 表達基因的情況下，誘導型啟動子是首選的調節元件。相比之下，在需要在植物的整個細胞 中持續表達的情況下，采用組成型啟動子。可以在轉化載體的表達構建體中包括位于核心 啟動子序列上游和/或下游的另外調節序列，以便引起異源核苷酸序列在轉基因植物中不 同水平的表達。 常常需要在植物的特定組織或器官中表達DNA序列。例如，可以通過遺傳操縱植 物的基因組以包含可操作連接至異源病原體抗性基因的組織優選啟動子，從而在所需植物 組織中產生病原體抗性蛋白質，實現植物對土源和空氣源病原體感染的抗性增加。或者， 可能需要抑制植物組織內的天然DNA序列的表達以實現所需的表型。在這個情況中，可以 如下實現這種抑制：將植物轉化以使其包含可操作連接至反義核苷酸序列的組織優選啟動 子，從而該反義序列的表達產生了干擾天然DNA序列的mRNA翻譯的RNA轉錄物。 另外，可能需要在處于特定生長或發育階段（例如細胞分裂或伸長）的植物組織 中表達DNA序列。這種DNA序列可用于促進或抑制植物生長過程，從而影響植物的生長速 率或結構（architecture)。 為了影響植物的各種性狀和為了與可評分標志物（scorable marker) -起使用， 需要分離和表征胚珠體細胞（somatic ovule)組織優選的啟動子，特別是能在種子發育早 期充當目的分離核苷酸序列的表達的調節元件的啟動子。
技術實現思路
提供用于調節植物中基因表達的組合物和方法。組合物包含在授粉之前、授粉過 程中和授粉之后在胚珠體細胞組織中活躍的啟動子的新型核苷酸序列。這種優選表達對于 篩選不定胚生殖是特別合乎需要的。更具體而言，該啟動子在胚珠中活躍，大約在受精時和 在受精之前直至球形胚形成為止主要在擬南芥（Arabidopsis)的內珠被的珠孔端。本專利技術 的某些實施例包含SEQ ID NO :3-8和33所示的核苷酸序列及其功能片段，其驅動可操作連 接的核苷酸序列的胚珠優選表達。本專利技術的實施例還包括包含可操作連接到目的異源核苷 酸序列的啟動子的DNA構建體，其中所述啟動子能夠驅動所述核苷酸序列在植物細胞中的 表達，并且所述啟動子包含本文公開的核苷酸序列中的一個。本專利技術的實施例還提供表達 載體，以及在其基因組中穩定摻入了如上所述的DNA構建體的植物或植物細胞。另外，組合 物包括這種植物的轉基因種子。具有這種優選空間和時間表達的啟動子對于雙子葉植物中 的不定胚生殖是特別合乎需要的。不定胚生殖是無孢子生殖的單性生殖（通過種子無性繁 殖）的組成部分，其在使穩定的、基于雜種的雜種優勢維持數代中將有用。 另外的實施例包括在植物中選擇性表達核苷酸序列的方法，該方法包括用DNA構 建體轉化植物細胞，并從所述植物細胞再生出轉化植物，所述DNA構建體包含本專利技術的啟 動子和可操作連接到所述啟動子的異源核苷酸序列，其中所述啟動子啟動所述核苷酸序列 在再生的植物中的胚珠優選轉錄。按這種方式，啟動子序列可用于以組織優選方式控制可 操作連接的編碼序列的表達。 在啟動子的轉錄起始區的下游將是目的序列，其將提供對植物的表型的修飾。這 種修飾包括調節內源產物的生成（數量、相對分布等方面）或者外源表達產物的生成，以在 植物中提供新穎的或者經調節的功能或產物。例如，涵蓋編碼這樣的基因產物的異源核苷 酸序列，該基因產物賦予對除草劑、鹽、寒冷、干旱、病原體、線蟲或昆蟲的抗性或耐受性。 在另一個實施例中，提供了調節基因在穩定轉化的植物中的表達的方法，該方法 包括以下步驟：（a)用包含與至少一種核苷酸序列可操作連接的本專利技術的啟動子的DNA構 建體轉化植物細胞；(b)使該植物細胞在植物生長條件下生長，以及（c)從其中該連接的核 苷酸序列的表達改變該植物的表型的植物細胞再生出穩定轉化的植物。 【附圖說明】 圖l(A-D)示出了在胚珠中可操作連接至本專利技術的經修飾的NUCl(ALTl)啟動 子（PHP42329)的異源基因（GUS)的表達模式，該模式與和本專利技術的擬南芥NUC1啟動子 (PHP37811) -起所觀察到的模式相同。（A)為具有成熟胚囊的擬南芥胚珠的參考示意圖， 其示出了卵（紅色）、2個助細胞（綠色）、中央細胞（藍色）和3個反足細胞。表達處于 (B)大配子體階段、（C)卵階段和⑶球形胚階段。表達模式可見于內珠被的珠孔頂端，合 點地（chalazally)擴散穿過圍繞胚囊的珠孔一半的內珠被。在球形胚階段⑶期間，表達 從珠孔內珠被過渡到合點珠被，并且在心形胚階段，表達僅在與合點端（未示出）相對的珠 被中觀察到。 圖2示出了在（A)卵階段、(B)魚雷形胚階段和（C)晚期球形胚階段，在胚珠中可 操作連接至啟動子AT-CYP86C1的異源基因（DS-RED)的表達模式。該表達模式可見于內珠 被（A)的珠孔頂端，合點地擴散穿過內種皮以圍繞胚囊的基部，還擴散到外珠被（B)的珠孔 端，并且然后繼續合點地擴散穿過整個內種皮層（C)。 圖3和4示出了在卵階段，在胚珠中可操作連接至啟動子AT-CYP86C1的異源基因 (DS-RED)的表達模式。在成熟胚囊階段（卵階段），AT-CYP86C1 pro :Ds-Red表達局限于 圍繞胚囊的珠孔端并且與其相對的內珠被。 圖5示出了在卵/接合子階段，在胚珠中可操作連接至啟動子AT-CYP86C1的異源 基因（DS-RED)的表達模式。在受精時或在受精之后，AT-CYP86C1 pr〇:DS-Red表達仍局限 于圍繞胚囊的珠孔端并且與其相對的內珠被。表達在開始于胚珠的遠軸側上的內種皮層中 合點地延伸。 圖6(A和B)示出了在接合子階段，在胚珠中可操作連接至啟動子AT-CYP86C1的 異源基因（DS-RED)的表達模式。AT-CYP86C1 pr〇:DS-Red表達保持強烈地局限于圍繞胚 囊的珠孔端并且與其相對的內珠被。表達在開始于胚珠的遠軸側上的內種皮層中合點地延 伸。表達還可見于與胚囊的珠孔端相對的外珠被中。 圖7和8(7A-C和8A-C)示出了在魚雷形胚階段，在胚珠中可操作連接至啟動子 AT-CYP86C1的異源基因（DS-RED)的表達形式。AT-CYP86C1 pro:Ds-Red表達保持強烈地 局限于圍繞胚囊的珠孔端并且與其相對的內珠被。表達在與胚囊的珠孔端相對的外珠被中 變得更普遍和更強。表達在內種皮層中繼續合點地延伸。 圖9(A和B)示出了在球形胚階段，在胚珠中可操作連接至啟動子AT-CYP86C1的 異源基因（DS-RED)的表達模式。 圖10(A、B和C)示出了在晚期球形胚階段，在胚珠中可操作連接至啟動子 AT-CYP86C1的異源基因（DS-RED)的表達模式。 圖ll(A-D)示出了在接合子階段，在胚珠中可操作連接至啟動子AT_PPM(推定的 果膠甲酯酶）的異源基因（ZS-Green)的表達模式。對于ΑΤ-PPM啟動子，觀本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種分離的核酸分子，所述分離的核酸分子包含選自以下的多核苷酸：(a)包含SEQ?ID?NO：3、4、5、6、7、8和33核苷酸序列的核苷酸序列；(b)包含SEQ?ID?NO：3、4、5、6、7、8和33核苷酸序列的片段或變體的核苷酸序列，其中所述序列在植物細胞中啟動轉錄；(c)與(a)或(b)的所述多核苷酸互補的多核苷酸。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2012.01.06 US 61/5836461. 一種分尚的核酸分子，所述分尚的核酸分子包含選自以下的多核苷酸： (a) 包含SEQ ID NO :3、4、5、6、7、8和33核苷酸序列的核苷酸序列； (b) 包含SEQ ID N0:3、4、5、6、7、8和33核苷酸序列的片段或變體的核苷酸序列，其中 所述序列在植物細胞中啟動轉錄； (c) 與（a)或（b)的所述多核苷酸互補的多核苷酸。2. -種表達盒，所述表達盒包含可操作連接到目的異源多核苷酸的權利要求1所述的 多核苷酸。3. -種載體，所述載體包含權利要求2所述的表達盒。4. 一種植物細胞，所述植物細胞包含權利要求2所述的表達盒。5. 根據權利要求4所述的植物細胞，其中所述表達盒被穩定整合到所述植物細胞的基 因組中。6. 根據權利要求4所述的植物細胞，其中所述植物細胞來自單子葉植物。7. 根據權利要求6所述的植物細胞，其中所述單子葉植物選自包含下列的組：玉蜀黍、 小麥、水稻、大麥、高粱、粟、甘蔗和裸麥。8. -種植物，所述植物包含權利要求2所述的表達盒。9. 根據權利要求8所述的植物，其中所述植物是單子葉植物。10. 根據權利要求9所述的植物，其中所述單子葉植物選自包含下列的組：玉蜀黍、小 麥、水稻、大麥、高粱、粟、甘鹿和裸麥。11. 根據權利要求8所述的植物，其中所述植物是雙子葉植物。12. 根據權利要求9所述的植物，其中所述雙子葉植物選自包含下列的組：大豆、蕓苔 屬物種、棉花、紅花、煙草、苜蓿和向日葵。13. 根據權利要求2-12中任一項所述的植物，其中所述表達盒被穩定整合到所述植物 的基因組中。14. 一種權利要求8所述的植物的轉基因種子，其中所述種子包含所述表達盒。15. 根據權利要求8所述的植物，其中所述目的異源多核苷酸編碼參與器官發育、干細 胞發育、細胞生長刺激、器官發生、體細胞胚發生啟動、自繁殖植物和頂端分生組織發育的 基因產物。16. 根據權利要求15所述的植物，其中所述基因選自：WUS、CLAVATA、Babyboom、 LEC(leafy cotyledon)、RKD、EMBRY0MAKER、ARI7 MYB115 和 MYB118 基因。17. 根據權利要求8所述的植物，其中所述目的異源多核苷酸編碼賦予干旱耐受性、寒 冷耐受性、除草劑耐受性、病原體抗性或昆蟲抗性的基因產物。18. 根據權利要求8所述的植物，其中所述多核苷酸的表達改變所述植物的表型。19. 一種在植物或植物細胞中表達多核苷酸的方法，所述方法包括將包含可操作連接 到目的異...

【專利技術屬性】
技術研發人員：MA錢伯林，SJ拉維特，
申請(專利權)人：先鋒國際良種公司，
類型：發明
國別省市：美國;US