本發明專利技術公開了一種靜脈注射用乙型肝炎人免疫球蛋白的制備工藝，通過辛酸沉淀加層析法來提純蛋白，同時采用S/D滅活法加DV50納米膜除病毒，與傳統工藝相比，本發明專利技術收率高，純度高，除病毒率高，更加安全有效。
【技術實現步驟摘要】
一種靜脈注射用乙型肝炎人免疫球蛋白的制備工藝
本專利技術涉及一種靜脈注射用乙型肝炎人免疫球蛋白的制備工藝，屬于血液制品領域。
技術介紹
乙型肝炎免疫球蛋白(HBIG)是由乙型肝炎疫苗免疫健康獻漿員后采集的乙型肝炎表面抗體效價較高的血漿，經分離、提純、病毒滅活而制備的特異性免疫球蛋白，具有特異性被動免疫作用，能夠中和體內的乙肝表面抗原，并將病毒清除。早在20世紀70年代，法國就用HevacB巴斯德疫苗對志愿獻血者進行免疫，獲得制備HBIG所需的免疫血漿。除法國之外，美國和其他歐洲國家也相繼開發出HBIG，并在人體中得到廣泛應用。我國從上個世紀80年代后期開始研制HBIG，于90年代開發出該項血液制品，經臨床驗證效果良好，未發現不良反應。目前乙型肝炎免疫球蛋白在阻斷乙型肝炎圍產期傳播、預防輸血后乙型肝炎病毒感染、HBsAg陽性病人肝移植后的被動免疫預防、治療慢性乙肝病毒攜帶者、預防意外感染事故等方面均取得了非常好的臨床驗證。目前市場上主要是肌肉注射乙型肝炎人免疫球蛋白，但是肌肉注射乙型肝炎人免疫球蛋白由于其純度低、蛋白濃度高不能用于靜脈注射，因而不能應用于大劑量的治療因乙肝病毒引起肝硬化的肝臟移植術中。靜脈注射乙型肝炎人免疫球蛋白解決了肌注存在的不足，能夠實現大劑量的給藥，提高了乙型肝炎 的治愈率。目前的靜脈注射乙型肝炎人免疫球蛋白的生產廠家都采用低溫乙醇分離蛋白的方法，通過改變溶液pH、溫度及乙醇濃度進行蛋白分離提純，但是這種方法會對乙型肝炎表面抗體效價帶來影響，而且當制品中IgA和IgM過高時會影響制品的療效，比如IgA含量對缺乏IgA的患者是首要的不安全因素，可能會引起速發型類過敏反應，因此在制備過程中有必要降低該類成分的含量。由于該制品是通過靜脈注射方式來進行的，因此藥物的病毒安全性需要更多的關注。選擇一種合適的病毒滅活方式對于保證患者的用藥安全尤為重要。
技術實現思路
本專利技術主要針對上述問題提供一種靜脈注射用乙型肝炎人免疫球蛋白的制備工藝。本專利技術一種靜脈注射用乙型肝炎人免疫球蛋白的制備工藝，其制備工藝包括以下方面: 1、血漿融化:將乙型肝炎表面抗體效價≥8IU/ml的原料血漿于(T4°C融化； 2、組分分離:將步驟I中血漿用質量百分含量為0.85%的氯化鈉溶液稀釋血漿至蛋白質含量為4.5%~5.5%，調節pH值至7.0，加入95%乙醇至反應液乙醇濃度為25%，控制反應液溫度在_2'3°C，壓濾，得到組分I沉淀； 3、辛酸沉淀:將步驟2中組分I沉淀用2倍量的0.06M醋酸鹽緩沖液溶解，再用Imol/L醋酸調節pH至4.8，緩慢加入辛酸或辛酸鹽沉淀，過濾收集濾液； 4、第一步層析:將步驟3中濾液用磷酸鹽緩沖液調節為pH6.2,加入DEAE-Spherodex純化，得流穿液； 5、沉淀:將步驟4中得到的流穿液電導率調節為1200uS/cm，pH為6.0-6.5，壓濾，收集壓濾液； 6、S/D滅活:將步驟5中得到的壓濾液加入10%S/D溶液攪拌，得到混合液，將混合液移入滅活罐，攪拌升溫至24~26°C，放置24小時； 7、第二步層析:將步驟6中得到的混合液加入用平衡液預平衡好的DEAE-SephadexA-50凝膠柱，吸附I小時以上，收集凝膠，然后用洗脫液洗脫凝膠5次，收集洗脫后的蛋白洗脫液； 8、成品配制:將步驟7中的蛋白洗脫液過濾、澄清、超濾、透析，用lmol/L鹽酸調節PH3.8^4.4，乙型肝炎表面抗體效價≥100IU/ml，加麥芽糖使麥芽糖含量為10 ±1%，過濾除菌，分裝。其中步驟7的具體工藝為:①預處理:DEAE-S印hadex A-50凝膠柱用0.5mol/LNaOH浸泡2小時，然后用注射用水沖洗至中性；②平衡:將平衡液加入凝膠柱中，平衡液為0.15mol/L的NaCl ;③洗脫:通過將洗脫液加入凝膠中來洗脫凝膠上吸附的蛋白，洗脫液為0.50 mol/L 的 NaCl。其中制備的乙型肝炎人免疫球蛋白的規格為500IU/瓶、2000IU/瓶、2500IU/瓶、5000IU/ 瓶。在步驟2中，通過提高溶液中乙醇的濃度達到完全沉淀目標蛋白的目的。[0011 ] 在步驟3中，通過調節辛酸濃度不但能夠達到沉淀雜蛋白的目的，而且還能滅活病毒并保持IgG單體的天然狀態。在步驟4中,通過采用DEAE-Spherodex純化,進一步達到去除雜蛋白的目的。在步驟5中，通過調節電導率和pH去除溶液中過量的IgA和IgM。在步驟6中，通過采用S/D滅活方法能夠徹底去除溶液中脂包膜病毒，而且相對于低PH孵放來說，大大縮短的生產周期。在步驟7中，通過DEAE-S印hadex A_50凝膠柱吸附的方法，來達到完全吸附IgG的目的，最大限度的減少IgG浪費。本專利技術工藝制備的注射用乙型肝炎人免疫球蛋白和現有技術相比，純度更高，IgG單體與二聚體的含量高于同類產品，病毒安全性更高，具有廣闊的市場應用前景。【具體實施方式】實施例1、利用上述方法生產靜注乙型肝炎人免疫球蛋白: (1)血漿融化:將乙型肝炎表面抗體效價≥8IU/ml的原料血漿于(T4°C融化； (2)組分分離:將步驟(1)中血漿用質量百分含量為0.85%的氯化鈉溶液稀釋血漿至蛋白質含量為4.5%~5.5%，調節pH值至7.0，加入95%乙醇至反應液乙醇濃度為25%，控制反應液溫度在_2'3°C，壓濾，得到組分I沉淀； (3)辛酸沉淀:將步驟(2)中組分I沉淀用2倍量的0.06M醋酸鹽緩沖液溶解，再用lmol/L醋酸調節pH至4.8,緩慢加入辛酸或辛酸鹽沉淀,過濾收集濾液；(4)第一步層析:將步驟(3)中濾液用磷酸鹽緩沖液調節為pH6.2，加入DEAE-Spherodex純化,得流穿液； (5)沉淀:將步驟(4)中得到的流穿液電導率調節為1200us/cm，pH為6.0-6.5，壓濾，收集壓濾液； (6)S/D滅活:將步驟(5)中得到的壓濾液加入10%S/D溶液攪拌，得到混合液，將混合液移入滅活罐，攪拌升溫至24~26°C，放置24小時； (7)第二步層析:將步驟(6)中得到的混合液加入用平衡液預平衡好的DEAE-SephadexA-50凝膠柱，吸附I小時以上，收集凝膠，然后用洗脫液洗脫凝膠5次，收集洗脫后的蛋白洗脫液； (8)成品配制:將步驟(7)中的蛋白洗脫液過濾、澄清、超濾、透析，用lmol/L鹽酸調節pH3.8~4.4，乙型肝炎表面抗體效價≤100IU/ml，加麥芽糖使麥芽糖含量為10±1%，過濾除菌，分裝。實施例2、本制備方法滅活病毒工藝與低pH孵放滅活病毒工藝比較:本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種靜脈注射用乙型肝炎人免疫球蛋白的制備工藝，其特征是制備工藝如下：（1）血漿融化：將乙型肝炎表面抗體效價≥8IU/ml的原料血漿于0~4℃融化；（2）組分分離：將步驟（1）中血漿用質量百分含量為0.85%的氯化鈉溶液稀釋血漿至蛋白質含量為4.5%~5.5%，調節pH值至7.0，加入95%乙醇至反應液乙醇濃度為25%，控制反應液溫度在?2~?3℃，壓濾，所得組分Ⅰ沉淀；（3）辛酸沉淀：將步驟（2）中組分Ⅰ沉淀用2倍量的0.06M醋酸鹽緩沖液溶解，再用1mol/L醋酸調節pH至4.8，緩慢加入辛酸或辛酸鹽沉淀，過濾收集濾液；（4）第一步層析：將步驟（3）中濾液用磷酸鹽緩沖液調節為pH6.2，加入陰離子交換層析柱純化，得流穿液；（5）沉淀：將步驟（4）中得到的流穿液電導率調節為1200us/cm，pH為6.0~6.5，壓濾，收集壓濾液；（6）S/D滅活：將步驟（5）中得到的壓濾液加入10%S/D溶液攪拌，得到混合液，將混合液移入滅活罐，攪拌升溫至24~26℃，放置24小時；（7）第二步層析：將步驟（6）中得到的混合液加入用平衡液預平衡好的DEAE?Sephadex?A?50凝膠柱，吸附1小時以上，收集凝膠，然后用洗脫液洗脫凝膠5次，收集洗脫后的蛋白洗脫液；（8）成品配制：將步驟（7）中的蛋白洗脫液過濾、澄清、超濾、透析，用1mol/L鹽酸調節pH3.8~4.4，乙型肝炎表面抗體效價≥100IU/ml，加麥芽糖使麥芽糖含量為10±1%，過濾除菌，分裝。...
【技術特征摘要】
1.一種靜脈注射用乙型肝炎人免疫球蛋白的制備工藝，其特征是制備工藝如下: (1)血漿融化:將乙型肝炎表面抗體效價≥8IU/ml的原料血漿于(T4°C融化； (2)組分分離:將步驟(1)中血漿用質量百分含量為0.85%的氯化鈉溶液稀釋血漿至蛋白質含量為4.5%~5.5%，調節pH值至7.0，加入95%乙醇至反應液乙醇濃度為25%，控制反應液溫度在_2'3°C，壓濾，所得組分I沉淀； (3)辛酸沉淀:將步驟(2)中組分I沉淀用2倍量的0.06M醋酸鹽緩沖液溶解，再用lmol/L醋酸調節pH至4.8,緩慢加入辛酸或辛酸鹽沉淀,過濾收集濾液； (4)第一步層析:將步驟(3)中濾液用磷酸鹽緩沖液調節為pH6.2，加入陰離子交換層析柱純化，得流穿液； (5)沉淀:將步驟(4)中得到的流穿液電導率調節為1200us/cm，pH為6.0-6.5，壓濾，收集壓濾液； (6)S/D滅活:將步驟(5)中得到的壓濾液加入10%S/D溶液攪拌，得到混合液，將混合液移入滅活罐，攪拌升溫至24~26°C，放置24小時； (7)第二步層析:將...
【專利技術屬性】
技術研發人員：呂獻忠，蘇峰，
申請(專利權)人：新疆德源生物工程有限公司，
類型：發明
國別省市：新疆;65
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